枯草芽孢杆菌ＢＺＪＮ１发酵培养基和培养条件的优化

刘芳 廖先清 周荣华 饶犇 陈伟 黄大野 游景茂

摘要：对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BZJN1发酵培养基及培养条件进行优化。结果表明，BZJN1菌株最适发酵培养基为玉米粉25.0 g/L、鱼粉25.0 g/L、工业蛋白胨15.0 g/L、玉米浆5.0 g/L、碳酸钙1.0 g/L、硫酸镁0.3 g/L、磷酸二氢钾0.1 g/L。最适发酵培养条件为初始pH 7.0、培养温度30 ℃、接种量4%、转速220 r/min，在此条件下，发酵液芽孢数可达9.68×109 CFU/mL，相比初始基础发酵培养基及培养条件下的发酵水平提高了约2倍。

关键词：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）; 发酵培养基;条件;优化

中图分类号：TS201.3         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）20-0093-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.20.021           開放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Optimization of fermentation mediaum and conditions for Bacillus subtilis BZJN1

LIU Fang1，LIAO Xian-qing1，ZHOU Rong-hua1，RAO Ben1，CHEN Wei1，HUANG Da-ye1，YOU Jing-mao2

（1.Hubei Biopesticide Engineering Research Centre，Wuhan 430064，China;

2.Institute of Chinese Herbal Medicines，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Enshi 445000，Hubei，China）

Abstract： The fermentation media and conditions for the strain of Bacillus subtilis BZJN1 had been optimized. It showed that the composition of the optimized medium was as followings： Corn starch 25.0 g/L， fish meal 25.0 g/L， peptone 15.0 g/L， corn steep liquor 5.0 g/L， CaCO3 1.0 g/L， MgSO4 0.3 g/L and KH2PO4 0.1 g/L. The optimized fermentation condition was as following：Starting pH 7.0， temperature 30 ℃， inoculum ratio 4%， and stirring speed 220 r/min. The spore counts of the fermentation culture might reach 9.68×109 CFU/mL under the optimized condition with tthe optimized medium， which was about 2 times higher than that in the primary medium and fermentation condition.

Key words： Bacillus subtilis; fermentation medium; condition; optimization

芽孢杆菌在植物病虫害生物防治中应用较为广泛[1，2]。它们通过产生杀虫或抗菌活性、促进植物生长的物质，达到杀虫、防病及促生的作用。芽孢杆菌易于工业化生产，对人畜及环境安全，是一类重要的微生物农药资源。

前期研究中从白术体内分离到一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BZJN1菌株，该菌株对多种中药材致病真菌有较好的室内拮抗效果，田间试验表明，该菌株对白术根腐病具有较好的防治效果，并对白术有一定的促生增产效果，具有良好的应用开发前景[3]。本研究以发酵液中的芽孢数为指标，对该菌株发酵培养基、发酵培养条件进行优化[4-8]，以提高其发酵水平，为该菌株的工业化生产提供技术支撑。

1  材料与方法

1.1  材料

供试菌株枯草芽孢杆菌BZJN1由湖北省农业科学院中药材研究所从白术体内分离得到并保存。

供试培养基：①LB 培养基，胰蛋白胨10 g，氯化钠5 g，酵母提取物5 g，去离子水1 L，pH 7.0，500 mL三角瓶装液量为100 mL;②基础发酵培养基，葡萄糖10 g，酵母膏5 g，蛋白胨10 g，去离子水 1 L，pH 7.0，500 mL三角瓶装液量为50 mL;③发酵培养基，根据需要具体配制，500 mL三角瓶装液量为50 mL。

1.2  方法

1.2.1  种子液制备  将斜面菌种接种1环至LB液体种子培养基中，培养至对数期。

1.2.2  芽孢数的测定  采用稀释涂布平板计数法测定，稀释液涂布LB平板前置于80 ℃水浴20 min。

1.2.3  发酵培养基的优化

1）单因素筛选。①碳源。分别用10 g/L葡萄糖、甘油、蔗糖、玉米粉和玉米淀粉5种碳源作为惟一碳源，基础发酵培养基中的其他组分酵母膏、蛋白胨含量不变，pH 7.0，接种量为3%，于30 ℃、180 r/min条件下培养到芽孢脱落分离20%时下摇床，测定发酵液的芽孢数，确定最佳碳源。②氮源。固定碳源玉米粉10 g/L，分别以20 g/L尿素、鱼粉、豆粕、工业蛋白胨、酵母膏、蚕蛹粉、花生粕、芝麻粕和玉米浆9种氮源作为惟一氮源进行发酵培养，玉米浆用量按干物质含量折算。pH 7.0，接种量为3%，于30 ℃、180 r/min条件下培养到芽孢脱落分离20%时下摇床，测定发酵液的芽孢数，确定最佳氮源。

2）正交试验设计。在单因素试验基础上，以发酵液的芽孢数为考察指标，以玉米粉为碳源，鱼粉、工业蛋白胨、玉米浆为氮源，无机盐固定为碳酸钙1.0 g/L、硫酸镁0.3 g/L、磷酸二氢钾0.1 g/L，设计4因素3水平正交试验（表1），pH 7.0，接种量为3%，于30 ℃、180 r/min条件下培养到芽孢脱落分离20%时下摇床。

1.2.4  发酵培养条件的优化

①初始pH对BZJN1菌株生长的影响。调节最适发酵培养基的pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，按3%的接种量接种，于30 ℃、180 r/min条件下培养到芽孢脱落分离20%时下摇床，测定发酵液的芽孢数。

②培养温度对BZJN1菌株生长的影响。根据pH影响结果，按3%接种量将种子液转接到pH 7.0的最适发酵培养基中，分别置于25、30、35、40和45 ℃摇床，于180 r/min条件下培养到芽孢脱落分离20%时下摇床，测定发酵液的芽孢数。

③接种量对BZJN1菌株生长的影响。根据pH、培养温度影响结果，分别按1%、3%、5%、7%、9%的接种量接种到pH 7.0的最适发酵培养基中，于30 ℃、180 r/min条件下培养到芽孢脱落分离20%时下摇床，测定发酵液的芽孢数。

④摇床转速对BZJN1菌株生长的影响。根据pH、培养温度、接种量影响结果，按3%接种量将种子液转接到pH 7.0的最适发酵培养基中，分别以120、150、180、210、240 r/min的转速于30 ℃条件下培养到芽孢脱落分離20%时下摇床，测定发酵液的芽孢数。

⑤最适发酵培养条件的确定。在pH、温度、接种量以及转速单因素试验基础上，以发酵液的芽孢数为考察指标，设计4因素3水平正交试验（表2）确定最适培养条件，接种最适发酵培养基培养到芽孢脱落分离20%时下摇床。

2  结果与分析

2.1  发酵培养基的优化

2.1.1  碳源  从图1可以看出，不同碳源对枯草芽孢杆菌BZJN1发酵的芽孢数影响不一，其中玉米粉作为碳源的效果最好，芽孢数可达到3.52×109 CFU/mL，因此选择玉米粉为枯草芽孢杆菌BZJN1的碳源。

2.1.2  氮源  由图2可知，枯草芽孢杆菌BZJN1在含有鱼粉、工业蛋白胨、玉米浆的培养基中芽孢数较高，其中在鱼粉作为单一氮源的培养基中芽孢数可达4.64×109 CFU/mL，因此选择鱼粉、工业蛋白胨、玉米浆作为枯草芽孢杆菌BZJN1培养基的氮源。

2.1.3  正交试验结果  由表3和表4的结果分析可知，影响枯草芽孢杆菌BZJN1发酵水平主次因素关系表现为玉米粉>工业蛋白胨>鱼粉>玉米浆，玉米粉的F为2.394，对发酵的影响最大，而鱼粉、玉米浆对发酵的影响相对较小。枯草芽孢杆菌BZJN1的最适发酵培养基为：玉米粉25.0 g/L，鱼粉25.0 g/L，工业蛋白胨15.0 g/L，玉米浆5.0 g/L，碳酸钙1.0 g/L，硫酸镁0.3 g/L，磷酸二氢钾0.1 g/L。摇瓶发酵液芽孢数可达7.68×109 CFU/mL。

2.2  发酵条件的优化

2.2.1  初始pH  由图3可知，当初始pH为7.0时，枯草芽孢杆菌BZJN1芽孢数最高，可达7.54×109 CFU/mL，在后续正交试验中选择pH为6.5、7.0、7.5。

2.2.2  培养温度  由图4可知，当培养温度为30 ℃时枯草芽孢杆菌BZJN1的芽孢数最高，可达7.70×109 CFU/mL，在后续正交试验中选择培养温度为28、30、32 ℃。

2.2.3  接种量  由图5可知，在一定范围内，枯草芽孢杆菌BZJN1发酵液芽孢数随接种量的增加而增加，但当接种量>5%时，发酵液芽孢数呈下降趋势。因为3%接种量和5%接种量芽孢数差别不大，在后续正交试验中选择3%、4%、5%的接种量。

2.2.4  转速  如图6所示，随着摇床转速的增加，枯草芽孢杆菌BZJN1芽孢数也随之增加，转速为210 r/min时芽孢数最高，可达8.20×109 CFU/mL，在后续正交试验中选择转速为200、210、220 r/min。

2.2.5  正交试验结果  由表5和表6的结果分析可知，影响枯草芽孢杆菌BZJN1发酵水平培养条件的主次因素关系表现为pH>温度>转速>接种量，pH的F为1.799，对发酵的影响最大，而接种量对发酵的影响最小。枯草芽孢杆菌BZJN1的最适培养条件为：pH 7.0，温度30 ℃，接种量4%，转速220 r/min，在此培养条件下最适发酵培养基摇瓶发酵液芽孢数可达9.68×109 CFU/mL。

3  讨论

农业微生物制剂的生产必须考虑到其生产成本。一般来说，芽孢杆菌制剂的生产中培养基的成本占总成本的20%～35%。因此，在培养基成分的选择上，考虑其是否适宜于工业化发酵、来源是否容易、价格是否低廉。玉米粉作为碳源成分，易于获得;在氮源的选取上，选取迟效氮源鱼粉及速效氮源工业蛋白胨和玉米浆，以保证整个发酵过程中氮素的供应。通过对其发酵培养基及培养条件的优化，最终获得了最适发酵培养基及培养条件，枯草芽孢杆菌BZJN1的发酵液芽孢数从初始的基础发酵培养基的3.06×109 CFU/mL经过优化后增加到9.68×109 CFU/mL，发酵水平提高了约2倍，基本达到了工业化生产的要求。

在本研究中，以芽孢数为指标进行枯草芽孢杆菌BZJN1发酵培养基和培养条件的优化。但芽孢数只是芽孢杆菌活性的一部分，在该菌株的工业化生产前还需要结合其所产生的活性物质对发酵生产工艺条件进一步优化，以实现芽孢数及活性物质的高发酵水平。

参考文献：

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