黏蛋白-4在胰腺癌中的研究进展

林轩，王浩，崔云甫

（哈尔滨医科大学附属第二医院 胆胰外科，黑龙江 哈尔滨 150086）

根据2015年中国癌症统计数据，我国每年新增胰腺癌患者9万人，死于胰腺癌的患者7.9万人，患者的5年生存率仅为6%[1]。胰腺癌起病隐匿，诊断明确时往往已是晚期，获得根治性手术的几率低，且术后并发症多，复发率高。因胰腺癌具有高度异质性，其对放、化疗的敏感性差，缺乏特定的诊疗靶点。因此，寻找有效的靶点对于胰腺癌的诊断和治疗都至关重要。

黏蛋白（Mucin）家族，包括21种大分子糖蛋白。该家族的蛋白在胰腺癌中均存在异常表达及修饰，且与胰腺癌的不良预后相关[2]。黏蛋白-4（MUC4）是该家族的成员之一。MUC4兼具膜结合型蛋白和分泌型蛋白的特点（图1）[3]，最早于1991年在气管-支气管黏液中发现[4]。胰腺癌的转录组数据显示，在黏蛋白家族中，MUC4的过表达最为显著[5]。在正常胰腺导管组织中，难以检测到MUC4的RNA。然而，在胰腺上皮内瘤变的初始阶段即可检测到MUC4 RNA，且随着疾病的进展，MUC4 RNA表达水平逐渐升高[6]。MUC4可以诱导细胞分化，促进肿瘤的发生和转移，甚至与肿瘤的化疗耐药有关[7]。本文综述MUC4结构、功能及在胰腺癌中限制MUC4表达的方法。最后，我们展望以MUC4为治疗靶点所面临的挑战。

图1 MUC4的表达分布6

1 MUC4的结构

MUC4基因位于染色体的3q21区域，包含5 513个碱基对，最早由Porchet等[4]于1991年从气管-支气管黏膜cDNA文库中筛选出。由于MUC4分子量大，结构复杂，因此，其完整的序列直到1999年才被Moniaux等[8]鉴定出来。MUC4蛋白是一种跨膜糖蛋白，包含一段具有高度等位基因多态性、数目可变的串联重复序列（variable number tandem repeat，VNTR），因此，其主链分子量长达550～930 kDa。MUC4蛋白能在GDPH位点发生蛋白水解，分解成两个亚基：较大的MUC4α和较小的MUC4β[9]。MUC4α由一个由富含丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸残基的VNTR区域组成，并由大小、组成、结构各不相同的寡糖侧链修饰[10]。VNTR区域下游是黏着相关（AMOP）结构域和类巢蛋白（NIDO）结构域。MUC4β包含1个血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWD）结构域、3个类表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）样结构域、1个跨膜蛋白和1段22个氨基酸构成的胞内片段（cytoplasmic tail，CT）。其中，NIDO、AMOP和vWD是属于MUC4的独特结构域，不存在于其他的黏蛋白中[11]（图2）。

图2 MUC4的结构示意图[12]。MUC4可在GDPH位点分解为MUC4α和MUC4β。MUC4α包含一段数目可变的串联重复区域（tandem repeat region）类巢蛋白（NIDO）结构域和黏着相关（AMOP）结构域。MUC4β包含1个血管性血友病因子（vWD）结构域、3个类表皮生长因子（EGF）样结构域、1个跨膜蛋白和1段22个氨基酸构成的胞内片段（CT）。

2 MUC4的表达

2.1 MUC4的生理性表达

在多种组织，如食管，空肠，结肠，回肠中都能检测到MUC4 RNA[13]，但在肝脏、胆道和胰腺组织中尚未检测到MUC4 RNA[14]。MUC4是一种跨膜黏蛋白，但其在GDPH位点发生的蛋白水解，使其成为一种分泌型蛋白，从而能在唾液、乳液和泪液等分泌物中检测到其RNA[12]。

2.2 MUC4在胰腺组织与癌组织中的表达

在正常胰腺和慢性胰腺炎等炎症性疾病中无法检测到MUC4的表达，但在胰腺癌的癌前病变中即可检测到MUC4的表达，并且其表达水平随胰腺癌的进展而逐渐升高[6]。2002年，Swartz等[15]在胰腺组织的免疫组化染色结果中发现，MUC4染色阳性率由胰腺上皮内瘤变（n=30）中的17%逐渐增加至胰腺癌中的89%（n=28）。2006年，Jhala等[16]发现在胰腺癌中，90%以上的组织样本的MUC4染色为阳性（n=40，P＜0.01）。2008年，Yonezawa等[6]发现胰腺癌中MUC4的染色阳性率是导管内乳头状黏液性肿瘤（IPMNs）的2倍。这表明从IPMNs到胰腺癌的过程中，MUC4的表达显著提高。2013年，Ansari等[17]发现MUC4染色阳性率在胰腺癌原发灶和肿瘤转移性淋巴结中呈高度一致性（82%），这提示MUC4在转移过程中持续表达。MUC4或许可以成为胰腺癌的肿瘤标志物。但以上研究仅基于术后病理的免疫组化染色，胰腺癌患者的血液或体液中MUC4的表达水平与正常人是否存在差异还有待验证，这也是MUC4能否成为肿瘤标志物的关键。

3 MUC4在胰腺癌中的作用

3.1 MUC4对癌细胞的影响

在胰腺癌中，MUC4通过类EGF样结构域与EGFR家族的生长因子受体，如正常上皮基底外侧的人类表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor，HER2）和人类表皮生长因子受体-3（HER3）相互作用。Carraway等[18]发现在大鼠体内，MUC4/Asgp2/Sialomucin复合物中的两个类EGF样结构域能够调节原癌基因ERBB2的活性。人MUC4蛋白包含3个类EGF样结构域，这三个结构域能与ERBB3结合形成稳定的异源二聚体[19]。该二聚体可以激活MAPK、JNK和STAT-1等信号通路，从而促进肿瘤的增殖和转移[20]。MUC4还能调节E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白信号通路，促进细胞锚定非依赖性增殖及上皮向间质的转化[21]。此外，MUC4蛋白中大的寡糖侧链可以形成空间障碍，从而阻止配体与受体相互作用，并破坏正常的细胞-细胞和细胞-基质间的相互作用[22]且其调控细胞进程的能力与细胞密度相关[23]。

3.2 MUC4在肿瘤微环境中的作用

MUC4蛋白具有膜结合型蛋白的特点，能从细胞表面延伸，与细胞外基质中的成分（如蛋白、免疫细胞、血管内皮等）发生相互作用[10]。在MiaPaCa胰腺癌细胞系中，Senapati等[7]发现MUC4中NIDO结构域的缺失，能使癌细胞与细胞外基质中的Fibulin-2的黏附减少，癌细胞侵袭和转移能力降低。MUC4也能与免疫细胞相互作用。Komatsu等[24]发现，唾液黏蛋白复合物（大鼠MUC4同源物）可以隐蔽细胞表面的肿瘤相关抗原表位，使免疫细胞对其的杀伤能力减弱，从而实现免疫逃逸。Zhu等[25]发现MUC4可以不依赖Fas配体，通过细胞-细胞接触的方式增加特异性细胞毒性T细胞（CTL）的凋亡。Inman等[26]发现相较其他免疫细胞，胰腺肿瘤中CTL丰度较低。但这个现象背后的机制尚不明确，MUC4与CTL之间的关系还需要进一步验证。

2012年，Geng等[27]证明了MUC4可以与表达E-选择素、P-选择素的内皮细胞相互作用，促进内皮细胞之间的黏附和肿瘤的转移。Senapati等[28]发现循环中的半乳糖苷-3可与MUC4结合，使MUC4积聚，增强MUC4与内皮细胞的相互作用，并促进肿瘤的转移。2016年，Tang等[29]发现，MUC4/Y中的AMOP结构域对血管内皮生长因子A和血管生成素2的表达有显著影响，该结构域的缺失明显减少了胰腺癌细胞周围血管的生成。2017年，Zhu等[11]编码了敲除特定结构域的MUC4基因，建立了一系列NIDO、AMOP和vWD结构域被单独或同时删除的MUC4/Y蛋白，并在BXPC-3细胞系中证明，这些结构域的缺失能降低胰腺细胞的癌变率。在肿瘤的发生和转移的过程中，这三个结构域起到相互促进的作用。

3.3 MUC4与化疗耐药

吉西他滨是胰腺癌一线化疗方案的首选药物之一。2009年，Bafna等[30]发现MUC4通过调控HER2受体来减少细胞色素C的释放，从而抑制吉西他滨介导细胞凋亡的功能，并诱导癌细胞对吉西他滨产生耐药性。2010年，Hagmann等[31]发现MUC4的过表达导致几种关键的ATP结合盒转运蛋白和多药耐药蛋白高表达。2012年，Skrypek等[32]发现，在胰腺癌中，MUC4与核苷转运蛋白-1的表达呈正相关。MUC4在胰腺癌细胞中的过表达使核苷转运蛋白的表达升高，促使细胞将内部的吉西他滨转运至胞外，从而增强癌细胞对化疗药物的耐药性。2014年，Ansari等[33]证明下调MUC4的表达可以提高吉西他滨对癌细胞的化疗敏感性。2017年，Urey等[34]进一步证实了MUC4表达的临床意义：在肿瘤可切除和接受吉西他滨治疗的胰腺癌患者中，MUC4高表达与患者的不良预后相关。以上研究为MUC4介导的肿瘤细胞化疗耐药提供了依据，针对MUC4的靶向治疗能阻止肿瘤细胞产生耐药性，有望改善患者的预后。

4 以MUC4为靶点治疗胰腺癌的方法

随着对MUC4的深入研究，对其在胰腺癌中的作用和机制有了进一步的了解，为以其为靶点的治疗方案提供了有力的支持。由于MUC4在胰腺癌中过表达，最直接的方法即通过基因沉默下调其表达。其次，则或通过药物抑制使MUC4上调的信号通路，间接下调MUC4的表达。

4.1 通过RNA调控MUC4的表达

2004年，Singh等[35]通过含有抗MUC4的RNA质粒沉默胰腺癌细胞系中的MUC4基因，证明了下调MUC4的表达可以抑制癌细胞的生长和转移。2008—2012年，Chaturvedi等[36]和Jonckheere等[20]先后通过靶向MUC4的寡核苷酸和逆转录病毒载体来下调MUC4的表达。MUC4表达的下调能降低HER2的稳定性，从而使肿瘤的活性降低。此外，通过逆转录病毒载体下调MUC4的表达可以提高吉西他滨对癌细胞的化疗敏感性[32]。2016年，Li等[37]在BxPC-3细胞系中证明抗MUC4的逆转录病毒载体可以抑制肿瘤的转移。但是，基于RNA载体来沉默MUC4基因的方法尚未在动物体内实验中验证其效应。在生物体内，将逆转录病毒或其他RNA载体精准递送到指定区域并确保其正常表达的方法尚未提出。在体内，通过逆转录病毒或其他RNA载体来调控MUC4的表达仍是一个挑战。

4.2 药物调控MUC4的表达

现已知，以地塞米松为代表的糖皮质激素及EGFR抑制剂对MUC4有调控作用。在1995年，Gollub等[38]最早发现在部分气道上皮细胞中，地塞米松能够上调MUC4的表达。2007年，Bai等[39]发现，在角膜、鼻息肉来源的上皮细胞中，地塞米松可以下调MUC4的表达。随后，2008年，Martinez等[40]发现，口服或鼻内吸入皮质类固醇，会提高鼻息肉中MUC1和MUC4的表达水平。2010年，Woo等[41]则发现地塞米松对鼻黏膜中MUC4的表达没有影响。在胰腺外科的临床实践中，地塞米松经常应用于围手术期的处理，同时也经常作为辅助用药，应用于化疗、放疗中。但这些临床应用是基于糖皮质激素的基本药理学效应，所以使用时间相对短暂。其针对MUC4表达的调控能力具有潜在的使用价值。但是，考虑到地塞米松对MUC4的调控尚存在争议，在胰腺癌中，其对MUC4的作用还需进一步评价。

EFGR抑制剂，如厄洛替尼，阿法替尼和卡奈替尼等可与吉西他滨联用，治疗晚期胰腺癌[42]。2008年，Chaturvedi等[36]发现在胰腺癌中，MUC4可与EGFR家族中的受体，如HRB1、HRB2等协同作用，加速疾病的进展。2015年内，Seshacharyulu等[43]证明卡奈替尼和阿法替尼可下调胰腺癌中MUC4的表达，但只有卡奈替尼下调MUC4表达的过程是不可逆的。而厄洛替尼对MUC4的调节作用尚不明确。EGFR受体抑制剂可调控MUC4的表达，但该类药物作用广泛，还可以作用于ERK1、cyclinD1、cyclinA、PAKT等信号通路或细胞因子来抑制胰腺癌的活性，其通过调控MUC4表达来抑制胰腺癌进展的机制还有待进一步明确。

4.3 基于MUC4的免疫疗法

免疫反应在肿瘤的发生发展中起至关重要的作用，肿瘤免疫学也是当前的研究热点。在胰腺癌中，因为肿瘤的高度异质性，缺乏相应抗原表位，所以免疫疗法一直没有被深入研究。有效的抗原表位，必须满足以下三个条件：在肿瘤中的表达具有特异性；肿瘤中表达量大；免疫原性强，足以引起免疫应答[44]。MUC4符合抗原表位的标准。MUC4在全身正常组织中都存在表达，但其在胰腺癌中过表达，且出现了异常糖基化，此特点可与正常组织中的MUC4区分[45]。此外，胰腺癌中的MUC4具有较强的免疫原性。Chen等[46]在体外实验中证明，针对胰腺癌细胞，转染肿瘤相关抗原生存素的树突细胞可以介导强大的CTL反应。若同时将MUC4与生存素的mRNA转染入树突细胞，诱导的CTL反应较前者更为强大。MUC4还可以单独或与其他抗原联合，研制针对胰腺癌的特异性疫苗。但是，由于缺乏相应的动物模型，难以在体内还原正常和肿瘤特异性的MUC4蛋白，该研究无法进一步深入。此外，MUC4抗体也有望在治疗胰腺癌过程中起效[47]。已有实验中心针对MUC4的各个区域的特定结构，如串联重复序列、独特结构域、N端等，制作了不同的抗体[48]，但其细胞毒性、药物传递方式及抗肿瘤增殖及转移的能力还有待进一步评估。

5 展望

MUC4在正常胰腺组织中不表达，而从胰腺癌前病变至胰腺癌的过程中，表达逐渐增加且存在异常糖基化并能激活免疫反应。这使MUC4有望成为胰腺癌的治疗靶点。一系列体内和体外的实验验证了通过药物抑制剂，RNA载体和免疫疗法来治疗胰腺癌的潜力。但是，想将其投入临床仍存在巨大的挑战。在免疫疗法中，由于胰腺癌中的MUC4蛋白存在异常糖基化，使其结构发生改变，难以选择有效的抗原表位及抗体。通过RNA载体调节MUC4的表达时，缺少能将RNA载体递送至胰腺癌区域的精准递送系统。因为这些障碍，以MUC4为靶点的胰腺癌疗法的研究仍处于早期阶段。面对这些挑战，未来的研究应该集中在以下几个方面：（1）研发胰腺癌动物模型来评估MUC4靶向药物的疗效；（2）构建胰腺癌中MUC4的特异性结构并测试其免疫原性；（3）在体内寻找有效的递送系统将药物准确投递到胰腺癌区域；（4）寻找新的方法或特异性药物下调MUC4的表达。