一个结节性硬化症家系的临床特点与基因突变分析

刘亚青,王天成

(兰州大学第二医院神经内科,兰州 730030;*通讯作者,E-mail:liuyaqing-2008@126.com)

结节性硬化症(tuberous sclerosis complex,TSC)又称Bourneville病,是一种常染色体显性遗传性多系统受累的神经皮肤综合征,其发病率为1/6 000-1/10 000,男女发病率为2∶1,且无明显种族特异性。TSC可表现为皮脂腺瘤、癫痫、认知障碍,以及行为缺陷和错构瘤等,损害可分布在身体的各个部位[1,2],如肾、视网膜、心、肺和中枢神经系统等,严重影响患者的身心健康及生活质量。TSC是一种遗传异质性疾病,其致病基因为位于染色体9q34.13和16p13.3的TSC1和TSC2。本研究通过对一个TSC家系中的3例患者进行临床资料分析,并行癫痫相关基因的测序分析,以了解其遗传学病因,加深对该疾病的认识。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本病家系为甘肃省一汉族家系(见图1),三代共9名成员,其中男性3名,女性6名;患者3名,均为女性。

1.2 患者资料

1.2.1 先证者 女,20岁,于1岁2月开始出现突然愣神,原有动作停止,目光呆滞,伴头眼略向右侧偏转,面带微笑,面色发红,呼其不应,每次持续约十余秒后自行缓解,平均每月发作数次,间断服用抗癫痫药物发作控制不佳,于6岁时曾出现大发作1次,表现为突然双眼上翻,四肢僵直抽动,呼之不应,可伴有口唇及颜面发青,每次持续约1 min,此后规律服用“卡马西平”治疗,于10岁后再无任何形式癫痫发作,目前已停用抗癫痫药物8年。患者面部纤维血管瘤(见图2),以鼻部为中心,对称分布,呈针尖至米粒大小,腰背部鲨革斑,逐年增多增大,进入青春期后尤其明显。患者认知功能减退,完成初中学业,有轻度的焦虑抑郁情绪。患者头颅3.0T MRI示:未见明显异常;脑电图示:各导联可见中至高幅尖波、棘波、棘慢波发放,以右侧为著;心脏、肾脏超声及眼底检查均无明显异常。

图1 结节性硬化症患者家系图

1.2.2 先证者其妹妹 女,10岁,汉族。于6岁开始出现癫痫发作,表现为突然愣神,原有动作停止,目光呆滞,呼其不应,每次持续约十余秒后自行缓解,平均每周发作2-3次,服用“卡马西平”治疗效果不佳,于2年前同时添加“雷帕霉素”治疗后发作频次明显减少,平均2月发作1次。4岁时发现面部有结节,查体可见面部有大小不一的条状纤维血管瘤,以口周为著。患者学习成绩尚可,但较发病前有明显倒退。头颅3.0T MRI示:未见明显异常;脑电图示:右侧后颞区可见频发的尖波、尖慢波;心脏、肾脏超声及眼底检查均无明显异常。

1.2.3 先证者其母亲 女,46岁,汉族。无癫痫发作史,认知功能正常。自4岁后出现面部皮疹,随年龄增长逐渐增大、增多。皮肤科情况:前额、鼻部、面颊部、下颌部可见米粒大小淡红色、暗红色密集分布的纤维血管瘤,背部见鲨革斑(见图2),以右腰部最显著,最大的约1.5 cm×2.5 cm,质硬。曾查头颅CT示:未见明显异常。

A.先证者面部纤维血管瘤;B.先证者母亲前额、鼻部、面颊部、下颌部可见米粒大小淡红色、暗红色密集分布的纤维血管瘤;C.先证者母亲背部可见鲨革斑

1.3 分子遗传学检测

在取得TSC患儿父母的知情同意并签字后,采取先证者及其父母、妹妹的外周静脉血2 ml置于EDTA抗凝管中保存,送北京华康基因康旭医学检验所进行第二代测序技术分析。4份外周血标本分别提取DNA。首先将患儿DNA样本随机打断,利用Agilent SureSelect Target Enrichment System捕获探针试剂盒进行TSC1基因(23个外显子)、TSC2基因(41个外显子)的外显子及相邻区域的序列捕获以建立捕获文库。经扩增纯化后,应用NEXTSEQ 500测序仪(美国Illumina公司)上机测序。测序平台产生的原始数据Fastq文件经CASAVA software v1.8.2(Illumina)、BWA、Genome Analysis Toolkit(GATK)生物信息学软件分析后,与HGMD数据库、dbSNP数据库、1000 Genome数据库等公共数据库的资料进行比对,获得可疑的突变位点。然后对先证者及其父母、妹妹的DNA样本进行Sanger测序验证。

2 结果

2.1 临床特征

该家系共3代9人,男性3人,女性6人,患者3人,均为女性。发病年龄均在5岁以内,2例患者出现癫痫发作,1例以癫痫发作为首发症状,其发作类型包括复杂部分性发作和全身性强直发作,另外1例患者仅出现复杂部分性发作。1例患者经使用抗癫痫药物治疗有效并已停药8年仍无发作;1例患者使用抗癫痫药物治疗发作控制不佳,添加雷帕霉素后发作频次明显减少。3例患者生长发育程度与同龄人无明显差异,但有癫痫发作的患者认知功能有轻度减退,且均伴有不同程度的皮肤异常(血管纤维瘤、纤维斑)主要分布于前额部、鼻两侧、面颊部及腰背部,随年龄增长而变大、增多融合成片状。影像学检查为阴性。脑电图表现为正常或局灶性痫样放电。

2.2 DNA测序结果

检测到在先证者TSC1基因第8号外显子的无义突变c.733C>T(p.Arg245Ter),即TSC1基因第733位碱基由胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T),该变异导致编译第245号氨基酸Arg的密码子变为终止密码子,从而使肽链合成提前终止,为杂合性变异。先证者其父该位点未见异常,其母和妹妹该位点均为杂合子(见图3)。

检测基因TSC1，测序位置chr9:135796754，变异情况c.733C>T(箭头示突变位点)

3 讨论

TSC属神经皮肤综合征亚型,癫痫、智能减退、皮肤血管纤维瘤是其主要表现,同时,患者肾脏、心脏、肺、视网膜、骨骼及内分泌腺等器官均可受累[3]。TSC表型变异大,临床上仅29%的病人具备典型三联征,6%不具备三联征中任何一项症状[4]。本家系中先证者及其妹妹具有典型三联征,但认知损害为轻度,其母亲仅有一个主征皮肤异常,无癫痫发作和智能障碍。

癫痫发作是TSC患者就诊的常见主诉或首发症状,发作类型可多样,可同时有多种发作类型,多在1岁以内起病。本研究中,先证者于1岁2月首次出现癫痫发作,病程中共出现两种发作形式,包括复杂部分性发作和全身性强直阵挛发作,使用“卡马西平”治疗后已获得无发作并停药。其妹妹以皮肤损害为首发症状,于6岁出现癫痫发作,发作形式为复杂部分性发作,使用“卡马西平”治疗效果不佳,添加“雷帕霉素”后发作频率明显减少。这两例患者均有轻度的智能倒退,而其母亲仅有皮肤损害,无癫痫发作,智能倒退也不明显。TSC患者的认知功能,与癫痫发作出现的早晚、严重程度及发作类型有关,研究显示,60%的TSC患者有程度不同的智力低下[5]。皮肤改变是TSC的另一主要表现,约90%患者伴皮肤表现,包括面部血管纤维瘤、鲨革样斑、色素脱失斑、甲周纤维瘤等,并有年龄特征。中枢神经系统受累的结构特征主要是发育异常,包括皮质结节、室管膜下结节、灰质异位和白质异常、脑肿瘤,多发生在儿童或成年早期。扩散张量成像(DTI)在识别脑通路的微观结构异常方面比标准MRI更敏感,在临床上对TSC患者的诊断更有价值。[6]本研究中家系患者头颅MRI均未发现上述结构性异常,可能与TSC1突变引起的临床表型较轻有关。

TSC是一种常染色体显性遗传性疾病,致病基因为TSC1和TSC2两个肿瘤抑制基因。TSC1编码错构瘤蛋白hamartin,TSC2编码马铃薯球蛋白tuberin,二者能够相互作用形成一种复合体,参与调节细胞的增殖、生长、黏附和囊泡运输等[7]。当TSC基因发生突变时,解除TSC1/2复合体活性对mTOR的抑制,将激活mTOR信号通路,使细胞的生长调节失控,致使肿瘤形成[8],这是TSC发生发展的主要致病机制。近年的研究发现在TSC患者中,局灶性皮质发育异常和胶质细胞瘤等几种疾病中均发现mTOR信号通路被异常激活,而这几种疾病均与癫痫高度相关,提示mTOR信号通路参与了癫痫的发生[9]。国外虽已有报道应用mTOR抑制剂治疗TSC伴发的室管膜下巨细胞星形细胞瘤[10],雷帕霉素是mTOR的特异性抑制剂,已有文献证实雷帕霉素可减少TSC患儿癫痫发作频率[11]。在本家系中,先证者其妹妹也在抗癫痫药联用雷帕霉素后,发作频率明显减少。

截至目前已发现836个TSC1突变位点,2 345个TSC2突变位点,主要包括错义、无义、移码、剪切以及大片段缺失突变,其中TSC1主要以移码和剪切突变为主[12]。同时,文献报道TSC1或TSC2编码蛋白功能丧失的突变(框移突变或无义突变),或蛋白合成受阻(如基因大片段缺失),或通过功能预测确定影响蛋白功能的错义突变被定义为TSC的致病性突变[13]。在本家系中,3例患者均发现TSC1基因的c.733C>T(p.Arg245Ter)杂合无义突变,导致TSC1翻译第245号氨基酸Arg的密码子变为终止密码子,从而使肽链合成提前终止,成为无功能的截断蛋白,因此判定其为该家系的致病性突变,但患者的临床症状相对较轻,均有皮肤损害,可伴有癫痫发作,伴或不伴有轻度认知功能损害,无心脏、肾脏、眼底等其他脏器损害,与文献报道的TSC1突变比TSC2突变引起较轻的临床表型相一致。

总之,本研究对3例TSC患者进行了临床诊断,并通过基因手段进行确诊,提高了对该疾病的认识,也将为患者的遗传咨询及产前诊断带来很大的帮助。