HPLC分析大鼠血浆中β-蜕皮甾酮浓度及其初步药代动力学研究

朱裕林,戴浩志,桑 冉,孔令提,许 健,张 盛,陈卫东*

(1蚌埠医学院第一附属医院药剂科,蚌埠 233004;2安徽中医药大学;*通讯作者,E-mail:wdchen@ahtcm.edu.cn)

骨疏灵是以“阳虚、气虚、血瘀”为老年性骨质疏松症的主要病机为理论依据的组方,补肾壮骨、健脾益气、活血通络,抗骨质疏松症疗效显著[1,2]。采用“温阳、益气、活血”为法,以淫羊藿、牛膝、黄芪和牡蛎四味中药组成[3]。

牛膝为苋科植物牛膝(怀牛膝)的干燥根,甘酸性平,入肝、肾经,具活血、补肝骨、填精益髓、充髓坚骨的作用,是传统的治疗骨质疏松症的主要中药之一。β-蜕皮甾酮(β-ecdysterone)为牛膝的主要活性成分,是一种天然植物激素[4],可抑制成骨和软骨细胞凋亡[5,6]、提高成骨细胞活性并促进分化[7]、增加骨量[8],还具有神经保护[9]、延缓衰老[10,11]、降低血糖[11]等药理活性。

目前,β-蜕皮甾酮的实验研究主要局限于其药理和药效学方面的研究,有关生物样品中β-蜕皮甾酮的测定方法未见报道,与β-蜕皮甾酮相关的药代动力学研究亦未见报道,这严重限制了β-蜕皮甾酮的深入研究和开发。

本课题组在前期β-蜕皮甾酮体外HPLC样品分析的基础上[12],建立大鼠血浆中β-蜕皮甾酮的HPLC测定方法,并探究其初步药代动力学,为其进一步的现代化开发提供实验依据。

1 试药与仪器

1.1 试剂与药品

安替比林对照品(中国药品生物制品检定所,批号:100508-200301,纯度≥98.0%);β-蜕皮甾酮对照品(中国食品药品检定研究院,批号:111638-201706,纯度≥98.0%);甲醇(上海星可高纯溶剂有限公司,批号:021160401,色谱纯);乙腈(瑞典Oceanpak化学公司,批号:1601062164,色谱纯);甲酸(江苏强盛功能化学股份有限公司,批号:20140208,色谱纯);乙酸乙酯(江苏强盛功能化学股份有限公司,批号:20160601,色谱纯);羧甲基纤维素钠(CMC-Na)(安徽山河药用辅料有限公司,批号:20160620);超纯水(Milli-Q超纯水机自制);其余所用试剂为分析纯。

1.2 仪器

高效液相色谱仪(LC-15C,日本岛津);电子分析天平(AB135-S,德国METTLER TOLEDO公司);氮吹浓缩仪(MTN-2800D,天津奥特赛恩斯仪器有限公司);台式高速离心机(TG16-WS,天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。

1.3 实验动物

体质量(200±20)g的健康SPF级雄性3月龄SD大鼠12只,安徽医科大学试验动物中心提供,生产许可证号:SCXK(皖)2017-001。适应性饲养一周,自由进食和饮水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

检测波长263 nm,色谱柱:Unitary C18(4.6 nm×150 mm,5 μm),流动相:乙腈-0.1%甲酸(16∶84),柱温:30 ℃,流速:1.0 ml/min,进样量:20 μl。

2.2 供试品溶液制备

β-蜕皮甾酮标准储备液的制备:精密称取β-蜕皮甾酮对照品2.00 mg,置于10 ml容量瓶中,加乙酸乙酯溶解并定容至刻度,摇匀,即得浓度为200 μg/ml的β-蜕皮甾酮标准品储备液。同样方法制备安替比林标准储备液。

2.3 空白血浆制备与血浆样品处理

健康未给药SD大鼠6只,实验前禁食12 h,不禁水,眼眶取血置于涂肝素的离心管中,3 000 r/min离心10 min,取上清液即得空白血浆。精密吸取大鼠待测血浆100 μl置于1.5 ml EP管中,加入3.5 μg/ml安替比林50 μl和600 μl萃取剂。涡旋5 min后3 000 r/min低速离心15 min,取上清液置于1.5 ml离心管中,40 ℃氮气吹干。加入100 μl甲醇复溶混匀后以12 000 r/min高速离心10 min。精密吸取80 μl上清液置于EP管中。按“2.1”项下色谱条件进样分析,记录β-蜕皮甾酮峰面积与内标安替比林峰面积。

2.4 专属性考察

精密吸取大鼠空白血浆100 μl,加入浓度为5 μg/ml的β-蜕皮甾酮标准品溶液100 μl和3.5 μg/ml的安替比林标准品溶液50 μl。按“2.3”项下方法进行处理后,按“2.1”项下色谱条件进样,得到色谱图。β-蜕皮甾酮和安替比林的保留时间分别为14.23 min和19.31 min,β-蜕皮甾酮与内标安替比林的分离度大于1.5,不受血浆中内源性物质的干扰,专属性较好(见图1)。

2.5 标准曲线的建立及定量下限

标准曲线的建立:取80 μl大鼠空白血浆6份,分别加入系列浓度的β-蜕皮甾酮标准品溶液和安替比林标准溶液20 μl,混匀后得到β-蜕皮甾酮浓度分别为0.25,0.50,5.00,20.00,50.00,100.00 μg/ml的标准血浆样品,按“2.3”项下血浆样品处理方法进行处理,按“2.1”项下色谱条件进样,记录β-蜕皮甾酮和内标安替比林的色谱峰面积并计算其比值。以β-蜕皮甾酮峰面积与安替比林峰面积之比(Ai)为纵坐标,β-蜕皮甾酮的质量浓度C(μg/ml)为横坐标进行回归,得到相应线性回归方程。

β-蜕皮甾酮的标准曲线方程为Y=0.084 1X-0.011 4,R2=0.999 0,在0.25-100.00 μg/ml浓度范围内线性良好,符合体内生物样品分析要求,标准曲线见图2。

1.β-蜕皮甾酮,2.安替比林,保留时间分别为14.23和19.31 min

图2 β-蜕皮甾酮血浆样品标准曲线

定量下限的测定:平行配制β-蜕皮甾酮浓度为0.25 μg/ml的血浆生物样品6份,进样分析,记录β-蜕皮甾酮峰面积及安替比林峰面积,计算其比值(Ai)并将其带入所建立的标准曲线方程中,得到各份的实测浓度。定量下限为(0.25±0.01)μg/ml(n=6),RSD为3.29%,符合生物样品的分析要求。

2.6 精密度考察

日间精密度:分别配制3批β-蜕皮甾酮浓度分别为0.25,0.50,20.00,75.00 μg/ml的血浆生物样品,每一批为6份,置于-20 ℃冰箱中冷藏备用。样品按“2.3”项下方法进行处理,按“2.1”项下色谱条件连续进样3 d,记录β-蜕皮甾酮及安替比林峰面积,计算其比值(Ai)并将其带入标准曲线方程,得到实测浓度,计算日间精密度及RSD。

β-蜕皮甾酮浓度0.25-75.00 μg/ml的日内、日间精密度和准确度(见表1)。结果表明,日内、间精密度RSD均小于10%,符合生物样品检测要求。

表1 大鼠血浆中β-蜕皮甾酮日内精密度和日间精密度(n=6)

Table 1 Intra-day and inter-day precision of β-ecdysone in rat plasma(n=6)

标示浓度(μg/ml)日内精密度(μg/ml)RSD(%)日间精密度(μg/ml)RSD(%)0.250.248±0.029.090.241±0.039.090.500.495±0.037.880.512±0.036.2420.0020.520±1.728.4019.400±1.226.2875.0075.094±1.131.5074.903±1.491.99

2.7 提取回收率考察

精密吸取大鼠空白血浆100 μl,加入β-蜕皮甾酮标准储备液适量,配制低(0.50 μg/ml)、中(20.00 μg/ml)、高(75.00 μg/ml)浓度的标准血浆样品各6份(按照《中国药典》规定,低浓度是标准曲线中定量下限的3倍以内,中浓度就是中间浓度,高浓度就是标准曲线上限的75%),按“2.3”项下方法进行处理,按“2.1”项下的色谱条件进样,记录β-蜕皮甾酮及安替比林峰面积并计算其比值,将比值带入标准曲线方程计算实际浓度,按下面的公式计算提取回收率(%),提取回收率=(测得的浓度/实际加入浓度)×100%。

低、中、高浓度血浆样品提取回收率分别为(89.72±5.71)%,(90.6±5.01)%,(97.69±1.44)%,均大于85%(n=6,RSD<6%),符合生物样品方法学考察要求(见表2)。

表2 β-蜕皮甾酮血浆样品提取回收率(n=6)

Table 2 Extraction recovery of β-ecdysterone plasma sample(n=6)

标示浓度(μg/ml) x±s(μg/ml)RSD(%)0.5089.72±5.715.6720.0090.60±5.015.2575.0097.69±1.443.60

2.8 稳定性考察

配制β-蜕皮甾酮浓度为0.50,20.00,75.00 μg/ml和内标安替比林(3.50 μg/ml)的血浆标准样品,分别考察β-蜕皮甾酮室温放置稳定性(8 h)、反复冻融稳定性(-20 ℃)、进样器稳定性(12 h),结果见表3。

表3 β-蜕皮甾酮在大鼠血浆中的稳定性(n=6)

Table 3 Stability of β-ecdysterone in rat plasma(n=6)

标示浓度(μg/ml)室温放置8 h反复冻融(-20 ℃)进样器放置12 h x±s(μg/ml)RSD(%) x±s(μg/ml)RSD(%) x±s(μg/ml)RSD(%)0.500.52±0.059.620.53±0.0611.320.49±0.0510.2020.0020.11±1.366.7620.09±0.984.8819.89±1.095.4875.0074.80±0.851.1475.06±0.360.4874.71±1.121.50

由表3可知,β-蜕皮甾酮的血浆样品在室温下放置8 h、-20 ℃反复冻融3次以及进样器放置12 h的稳定性均良好,符合生物样品的分析要求。

2.9 β-蜕皮甾酮药代动力学实验

2.9.1 给药剂量及灌胃溶液的配制 鉴于没有β-蜕皮甾酮药代动力学文献参考,本实验中给药剂量参照2015版《中国药典》牛膝中β-蜕皮甾酮标示量要求,按照成人服用牛膝药材的日剂量换算,SD大鼠β-蜕皮甾酮给药剂量约为9.6 mg/kg,故取10 mg/kg为给药剂量。由于β蜕皮甾酮不溶于水,故制成CMC-Na混悬液。精密称取β-蜕皮甾酮原料药适量,将其溶于0.5%的CMC-Na溶液中,配制浓度为10 mg/ml的β-蜕皮甾酮原料药混悬液。

2.9.2 给药方式及样品采集 实验大鼠以上述浓度的β-蜕皮甾酮原料药混悬液分别按体质量1 ml/100 g进行灌胃,给药后5,10,15,30,45,60,90,120,180,300,420,720,1 440 min眼眦取血0.3 ml,置于干燥的肝素化的1.5 ml EP管中,3 000 r/min离心10 min,取上清得到含药血浆,置-20 ℃冰箱中冷冻,保存备用。

2.9.3 β-蜕皮甾酮药时曲线 按“2.9.2”项下采样方法采集血浆,按“2.3”项下血浆样品处理方法处理血浆,按“2.1”项下色谱条件进样分析。记录β-蜕皮甾酮和安替比林峰面积,计算其比值(Ai)并带入标准曲线中计算中测定血浆中β-蜕皮甾酮的浓度,根据所得值拟合药时曲线。结果见图3。

图3 β-蜕皮甾酮在大鼠血浆中的药物浓度-时间曲线 (n=6)

2.9.4 药物代谢动力学参数 将血药浓度结果进行药代动力学参数的计算,利用DAS 2.1药动学软件进行数据拟合。β-蜕皮甾酮的分布半衰期t1/2(α)为(1.02±0.06)h,消除半衰期t1/2(β)为(1.79±0.11)h,具体见表4。

表4 灌胃β-蜕皮甾酮后血浆的药动学参数(n=6)

Table 4 Pharmacokinetic parameters of plasma after intragastric administration of β-ecdysterone(n=6)

药代动力学参数 x±s Cmax(μg/ml)66.41±4.65 t1/2(α)(h)1.02±0.06 t1/2(β)(h)1.79±0.11 Tmax(h)1.00±0.00 CL[L/(h·kg)]0.40±0.02 AUC0-t[μg/(ml·h)]252.30±11.84AUC0-∞[μg/(ml·h))264.40±10.47

3 讨论

查阅文献未见生物样品中β-蜕皮甾酮的含量检测和药代动力学研究报道。参考本课题组前期研究基础[12]和部分国内研究报道[13-15]体外β-蜕皮甾酮含量检测方法,经前期预实验,本研究建立了一套较为完整、准确、重现性好的β-蜕皮甾酮体内药物浓度检测方法。

本研究中,处理血浆样品时初步考虑选择乙腈和甲醇作为蛋白沉淀剂,样品处理后进样发现β-蜕皮甾酮及内标响应程度较低,推测可能是样品稀释产生的结果;后续进行氮气吹干,发现乙腈和甲醇吹干过程耗时较长,不适合处理批量的生物样品,因此舍弃蛋白沉淀方法处理样品。尝试选择液液萃取法进行血浆样品前处理,考虑到乙酸乙酯为液液萃取法中常用的萃取剂,并且在转移时易于操作,因此选择乙酸乙酯进行液液萃取。值得注意的是,预实验时发现加入600 μl的乙酸乙酯时,利用氮吹法使待测组分浓缩富集后,血浆中β-蜕皮甾酮的相对回收率符合生物样品检测要求。测定结果显示,利用乙酸乙酯作为萃取剂的低、中、高浓度回收率依次为89.72%±5.71%、90.60%±5.01%和97.69%±1.44%,故本实验最终选择乙酸乙酯进行液液萃取法处理血浆样品。

体内色谱分析发现,β-蜕皮甾酮在乙腈中溶解度较好,但保留时间短,不易与血浆中的成分分离,故适当减小有机相比例来增加保留时间,达到良好的分离度。此外,内标安替比林吸收峰存在拖尾现象,流动相中加入甲酸调整内标峰型,二者具有相似的紫外吸收,且分离度良好。

通过对药代动力学参数的分析,首次确定β-蜕皮甾酮在大鼠体内的消除过程符合双室模型,其中t为61.41 min,表明β-蜕皮甾酮在中央室迅速达到分布平衡。血药浓度在1 h达到最大,为(66.41±4.65)μg/ml;CL为(0.40±0.02)L/(h·kg),表明β-蜕皮甾酮在血液中清除较快。β-蜕皮甾酮为脂溶性药物,体内代谢和清除受到肝脏的影响,具体受到何种代谢酶影响,有待进一步探究。

综上,本研究建立的大鼠血浆中β-蜕皮甾酮的HPLC测定方法,具有灵敏度高、专属性强而且简便准确的特点,满足生物样品的分析要求及β-蜕皮甾酮体内的初步药物代谢动力学研究。