基于Design-Expert回归分析的藜麦叶黄酮提取工艺优化

魏志敏，吕玮，裴美燕，宋世佳，卢川，刘秋红，李顺国*

（1.河北省农林科学院谷子研究所，河北省杂粮研究实验室，国家谷子改良中心，河北 石家庄 050035；2.国家半干旱农业工程技术研究中心，河北 石家庄 050051；3.邯郸市邯山区农业农村局，河北 邯郸 560000；4.河北医科大学临床医学院，河北石家庄 050000）

藜麦原产于安第斯山脉，有5 000 a以上的种植历史，是印加土著居民的主要传统食物，近年来藜麦叶的食用价值得到了人们越来越多的广泛认可。藜麦叶含有人体必需的氨基酸、维生素、微量元素等多种营养成分，还富含黄酮等多种生物活性成分，因此，具有较高的食用价值和一定的药用价值[1，2]。医学研究表明，黄酮类化合物具有抗氧化，改善血管弹性，抗癌、抗菌、杀菌，治疗冠心病、心绞病、高血压，止咳、平喘、祛痰等功效[3]。当前藜麦子粒已经成为功能食品研究利用的热点，受到各国消费者的广泛青睐，但对藜麦苗的保健成分研究还较少。

本项目以藜麦叶为试验原料，以总黄酮为研究对象，以乙醇作为提取溶剂，在单因素试验的基础上，采用Design-Expert分析对藜麦叶黄酮提取工艺进行优化，以期获得较高的提取率，为菜用藜麦在食品和药品领域的应用提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 藜麦苗 样品于2019年5月6日采自河北省农林科学院郄马试验站，株高15 cm，冷冻烘干后粉碎、研磨，过50目筛，装袋备用。

1.1.2 药剂 芦丁标准品：光谱纯，国药集团化学试剂有限公司生产；无水乙醇和氢氧化钠：分析纯，天津大茂化学试剂厂生产；亚硝酸钠和硝酸铝：分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司生产。

1.1.3 仪器与设备 6202高速粉碎机：北京环亚天元机械有限公司生产；UV-3200PCS型紫外-可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司生产；电子天平：精度0.1mg，上海奥豪斯有限公司生产；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵：上海青浦沪西仪器厂生产；RE-522A型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂生产；DK-S26型数显恒温水浴锅：苏州威尔实验用品有限公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的绘制 精密称取芦丁标准品5.0 mg置于25 mL容量瓶内，加入体积分数70%的乙醇溶液，充分溶解、摇匀后定容，得到0.2 mg/mL的芦丁标准溶液。分别准确吸取芦丁标准溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置于10 mL试管内，依次加入质量分数5%的NaNO2溶液0.3 mL混匀，室温下静置6 min后加质量分数10%的Al（NO3）3溶液0.3 mL摇匀，静置6 min后再加入质量分数4%的NaOH溶液4.0 mL，再用体积分数70%的乙醇溶液定容10 mL摇匀，放置15 min，以不加芦丁标准溶液处理为空白对照，用紫外分光光度计测定波长510 nm处的吸光度。每个处理重复3次，每个重复在测定吸光度时再重复测定3次，以吸光度（Y） 为纵坐标、浓度（mg/mL）为横坐标（X）绘制标准曲线。

1.2.2 单因素试验（单因素对藜麦叶黄酮提取量的影响） 准确称取1.00 g藜麦苗粉6份，分别置于100 mL圆底烧瓶中；然后，固定乙醇体积分数、提取温度、提取时间和液料比中的3个因素，进行不同单因素对黄酮提取量的影响试验。回流提取后，将提取液浓缩至近干，加体积分数70%的乙醇溶解并定容至50 mL，用紫外分光光度计测定波长510 nm处的吸光度。每个处理重复3次，每个重复在测定吸光度时再重复测定3次。

1.2.2.1 乙醇体积分数对黄酮提取量的影响。固定液料比（mL/g，下同） 25∶1，分别加入体积分数40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液25 mL，在温度60℃条件下回流提取100 min。

1.2.2.2 提取温度对黄酮提取量的影响。固定液料比25∶1，用体积分数70%的乙醇溶液25mL，分别在温度30、40、50、60、70、80℃条件下回流提取100 min。

1.2.2.3 提取时间对黄酮提取量的影响。固定液料比25∶1，用体积分数70%的乙醇溶液25 mL，在温度60℃条件下分别回流提取60、80、100、120、140、160 min。

1.2.2.4 液料比对黄酮提取量的影响。液料比分别设定为 10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1，用体积分数70%的乙醇溶液25 mL，在温度60℃条件下回流提取100 min。

1.2.3 响应面试验（响应面法对藜麦叶黄酮提取工艺的优化分析） 根据单因素试验结果，应用Design-Exper 10软件的中心组合设计方法，设计乙醇体积分数（A）、提取温度（B）、提取时间（C） 和液料比（D）4个因素的响应面试验。根据建立的数学模型，得到较优后的藜麦叶黄酮提取工艺。

1.2.4 数据统计分析 单因素试验数据采用Microsoft Office Excel 7.0软件进行统计并制图。根据单因素试验结果，应用Design-Exper 10软件的中心组合设计方法，进行乙醇体积分数（A）、提取温度（B）、提取时间（C） 和液料比（D） 四因素三水平（表1） 的响应面试验设计，得到2个不同因素互作的立体三维图。

2 结果与分析

2.1 芦丁浓度-吸光度标准曲线的绘制

依据不同浓度芦丁溶液的吸光度结果，绘制标准曲线（图1）。对试验数据进行回归分析，得到芦丁浓度-吸光度线性回归方程为Y=0.292x+0.014 781（R2=0.999 6）。可以看出，在芦丁浓度0.01～0.1 mg/mL范围内，吸光度与浓度呈正比。

图1 芦丁浓度-吸光度标准曲线Fig.1 Standard curve between concentration and absorbance of rutin

2.2 藜麦叶黄酮提取方法的单因素试验结果

2.2.1 乙醇体积分数对黄酮提取量的影响 在液料比25∶1、提取温度60℃、提取时间100 min条件下，藜麦叶片黄酮提取量随着乙醇体积分数的提高呈先增加后降低的变化，其中乙醇体积分数为70%时黄酮提取量最高（图2）。因此认为，最佳乙醇体积分数为70%。

图2 乙醇体积分数对黄酮提取量的影响Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on the extraction amount of flavonoid

2.2.2 提取温度对黄酮提取量的影响 在乙醇体积分数70%、液料比25∶1、提取时间60 min条件下，藜麦叶片黄酮提取量随着提取温度的升高呈先增加后降低的变化，其中提取温度为60℃时黄酮提取量最高（图3）。因此认为，最佳提取温度为60℃。

图3 提取温度对黄酮提取量的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction amount of flavonoid

2.2.3 提取时间对黄酮提取量的影响 在乙醇体积分数70%、液料比25∶1、提取温度60℃条件下，藜麦叶片黄酮提取量随着提取时间的延长呈先增加后降低的变化，其中提取时间为100 min时黄酮提取量最高（图4）。因此认为，最佳提取时间为100 min。

图4 提取时间对黄酮提取量的影响Fig.4 Effect of extraction time on the extraction amount of flavonoid

2.2.4 液料比对黄酮提取量的影响 在乙醇体积分数70%、提取温度为60℃、提取时间100 min条件下，黄酮提取量随着液料比的增大呈先增加后降低的变化，其中液料比为30∶1时黄酮提取量最高（图5）。因此认为，最佳液料比为30∶1。

2.3 藜麦叶黄酮提取方法的响应面优化分析结果

根据单因素试验结果，应用Design-Exper 10软件的中心组合设计方法，进行乙醇体积分数（A）、提取温度（B）、提取时间（C） 和液料比（D） 四因素三水平（表1）的响应面试验设计，共设计出29个组合（表2）。利用Design-Exper 10软件对试验结果进行分析，得到黄酮提取量（Y）对4个因素的二次多项回归方程：

Y=11.951 81+0.915 00A+0.511 667B+0.186 67C+0.86857D+0.04000AB-0.22000AC+0.43000AD+0.25500BC－0.88000BD+0.09500CD-1.84614A2-1.996 14B2-1.473 64C2-2.267 27D2

图5 液料比对黄酮提取量的影响Fig.5 Effect of liquid material ratio on the extraction amount of flavonoid

表1 响应面分析因素水平表Table 1 Factors and levels in response surface design

表2 藜麦叶黄酮提取量的响应面试验设计与结果Table 2 Response surface test design and results of extraction amount of flavonoid from quinoa

对回归方程进行方差分析，结果（表3）显示，模型P（0.0004） ＜0.05，同时失拟项 P（0.2176） ＞0.1000，表示正交试验结果可以与数学模型拟合良好。各因素对黄酮提取量的影响程度顺序为提取时间＜提取温度＜乙醇体积＜液料比，其中乙醇体积和液料比对黄酮提取量的影响达到了极显著水平。

响应面图形是响应值对应于试验因子A、B、C、D所构成的三维空间的曲面图，从响应面分析图上可以直观形象地看出响应值与各参数之间相互作用产生的影响。根据回归方程得出不同因子的响应面分析图（图6～11），可以较直观地看出两因素交互作用对藜麦叶中总黄酮得率的影响。若弯曲程度大，则表明该因素对总黄酮提取量的影响越大，相应表现为响应值变化的大小。通过软件Design-Expert分析，确定最佳黄酮提取工艺为乙醇体积分数70%、液料比30∶1、提取时间100 min、提取温度61℃，黄酮提取量最大值为12.41 mg/g。测定结果稳定，与理论预测值吻合。

表3 回归模型的方差分析结果Table 3 Variance analysis results of regression model

3 结论与讨论

本研究中，首先分别考察了乙醇体积分数、浸提时间、浸提温度和液料比对藜麦叶黄酮提取量的影响，结果显示，随着4个因素水平的升高，黄酮类物质含量呈先增加后降低的变化。随着乙醇体积分数的增大，藜麦叶黄酮得量呈先增加后减少的趋势，当乙醇体积分数为70%时，总黄酮得量最大。说明当乙醇体积分数大于70%时，溶剂的极性降低，导致黄酮类物质的溶解度降低。随着提取温度的升高，黄酮类物质的溶解和扩散速度加快，从而有利于物质的提取；同时，黄酮类物质氧化反应速度也加快，不利于提取。确定恰当的温度是重要参数，本研究中最佳提取温度为60℃。提取时间过短，不能充分提取黄酮类物质；提取时间过长，氧化反应会导致黄酮类物质结构破坏，也不利于提取。本研究条件下，提取时间为100 min时得到的黄酮量最多。液料比增大可促进藜麦叶粉的溶解和扩散，但是达到平衡后，继续增加液料比反而不利于黄酮的提取，当液料比为30∶1时提取的黄酮量最多。在单因素试验的基础上设计响应面试验，结果显示，在乙醇体积分数65%、液料比35∶1、提取时间100 min、提取温度60℃条件下，黄酮提取量可以达到12.36 mg/g。

图6 乙醇体积分数与提取温度交互作用对黄酮提取量的等高线（A）和响应面图（B）Fig.6 Interaction effect of ethanol volume fraction and extraction temperature on the contour and response surface diagram of extraction amount of flavonoid

图7 乙醇体积分数与提取时间交互作用对黄酮提取量的等高线（A）和响应面图（B）Fig.7 Interaction effect of ethanol volume fraction and extraction time on the contour and response surface diagram of the extraction amount of flavonoids

图8 提取温度与提取时间交互作用对黄酮提取量的等高线（A）和响应面图（B）Fig.8 Interaction effect of extraction temperature and extraction time on the contour and response surface diagram of extraction amount of flavonoid

图9 乙醇体积分数与液料比交互作用对黄酮提取量的等高线（A）和响应面图（B）Fig.9 Interaction effect of ethanol volume fraction and liquid material ratio on the contour and response surface diagram of extraction amount of flavonoid

图10 液料比与提取温度交互作用对黄酮提取量的等高线（A）和响应面图（B）Fig.10 Interaction effect of liquid material ratio and extraction temperature on the contour and response surface diagram of extraction amount of flavonoid

图11 液料比与提取时间交互作用对黄酮提取量的等高线（A）和响应面图（B）Fig.11 Interaction effect of liquid material ratio and extraction time on the contour and response surface diagram of extraction amount of flavonoid

采用Design-Expert软件的中心组合设计方法设计响应面试验，建立数学模型，得到了较优的提取工艺条件。并结合响应面分析得到的数学模型，预测更优的工艺条件，并进行3次验证试验，最后得到了从藜麦叶提取黄酮的最佳工艺条件为乙醇体积分数68%、液料比32∶1、提取时间100 min、提取温度61℃，该条件下黄酮提取量可以达到（12.41±0.03） mg/g。预测值与实际测定值接近，说明此响应面法得到的回归模型具有一定的可靠性。