miR-320靶向调控FoxM1对结肠癌SW480细胞增殖、侵袭的影响
2019-12-10董伟戴涵斌朱沛枫徐永强
董伟 戴涵斌 朱沛枫 徐永强
[摘要] 目的 分析miR-320對结肠癌SW480细胞增殖、侵袭的影响及其作用机制。 方法 将SW480细胞分为SW480组、mimic对照组、miR-320 mimic-/FoxM1 wt+/FoxM1 mut-组、miR-320 mimic+/FoxM1 wt +/FoxM1 mut-组、miR-320 mimic-/FoxM1 wt -/FoxM1 mut+组、miR-320 mimic+/FoxM1 wt-/FoxM1 mut+组、miR-320 mimic组、pc-FoxM1组、miR-320 mimic+pc-FoxM1组;检测各组细胞内凋亡、增殖、侵袭等相关指标。 结果 miR-320 mimic细胞表达miR-320量显著升高(P<0.05),FoxM1表达量显著降低(P<0.05),荧光素酶报告实验结果显示,与FoxM1 wt组比较,FoxM1 wt+miR-320组荧光素酶活性显著降低(P<0.05);miR-320 mimic+pc-FoxM1组细胞细胞增殖数及PCNA蛋白表达水平均显著高于miR-320 mimic组(P<0.05);与miR-320 mimic组相比,miR-320 mimic+pc-FoxM1组细胞cleaved Caspase-9表达水平显著降低(P<0.05);与miR-320 mimic组相比, miR-320 mimic+pc-FoxM1组细胞迁移率显著升高(P<0.05);与miR-320 mimic组相比,miR-320 mimic+pc-FoxM1组细胞侵袭数显著升高(P<0.05)。 结论 miR-320通过靶向调控FoxM1实现抑制结肠癌SW480细胞增殖、侵袭能力。
[关键词] miR-320;FoxM1;SW480细胞;增殖;侵袭
[中图分类号] R735.35 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2019)26-0033-04
[Abstract] Objective To analyze the effect of miR-320 on proliferation and invasion of colon cancer SW480 cells and its mechanism. Methods SW480 cells were divided into SW480 group, mimic control group, miR-320 mimic-/FoxM1 wt+/FoxM1 mut-group, miR-320 mimic+/FoxM1 wt +/FoxM1 mut-group, miR-320 mimic-/FoxM1 wt -/FoxM1 mut+ group, miR-320 mimic+/FoxM1 wt-/FoxM1 mut+group, miR-320 mimic group, pc-FoxM1 group, miR-320 mimic+pc-FoxM1 group. The proliferation, invasion and other related indicators between groups were compared. Results The expression of miR-320 in miR-320 mimic cells was significantly increased(P<0.05), and the expression of FoxM1 was significantly decreased(P<0.05). The results of luciferase reporter assay showed that the luciferase activity of FoxM1 wt+miR-320 was significantly decreased compared with that of the FoxM1 wt group(P<0.05). The cell proliferation and PCNA protein expression of miR-320 mimic+pc-FoxM1 group were significantly higher than that of miR-320 mimic group(P<0.05). Compared with that of the miR-320 mimic group, cell migration rate of miR-320 mimic+pc-FoxM1 group was significantly increased(P<0.05), and the expression level of cleaved Caspase-9 in the miR-320 mimic+pc-FoxM1 group was significantly lower(P<0.05). Compared with that of the miR-320 mimic group, the number of cell invasion was significantly increased in the miR-320 mimic+pc-FoxM1 group(P<0.05). Conclusion miR-320 can inhibit the proliferation and invasion of colon cancer SW480 cells by targeting FoxM1.
[Key words] miR-320; FoxM1; SW480 cells; Proliferation; Invasion
结肠癌是目前临床中最为常见的恶性肿瘤,也是目前死亡率较高的恶性肿瘤之一[1]。有研究结果显示,每年全球范围内约有100万人被确诊为结肠癌,且约60万人死于本病[2]。近年来,随着临床治疗和诊断水平的提高和改善,在西方国家中结肠癌的死亡率虽有一定程度降低,但包括我国在内的多数发展中国家的发病率及病死率仍呈现逐年增高趋势[3]。因而对结肠癌的临床发病机制进行深入研究,并寻找有效及时诊断结肠癌的方案具有十分重要的意义[4]。有研究结果显示,在肿瘤基因表达及疾病发生过程中微小RNA(miRNA,micro RNA)起到十分重要的作用[5]。有学者研究指出,miRNA异常与肿瘤细胞的转移、增殖密切相关,并可能参与肿瘤细胞的凋亡调控,加速肿瘤进展[6]。miR-320属于经典的抑癌基因,在多种肿瘤细胞中呈明显异常低表达状态[7]。但miR-320在肿瘤细胞中的调控作用机制仍未完全揭示,因而本课题通过调控SW480结肠癌细胞中miR-320表达,分析miR-320调控结肠癌SW480细胞增殖、侵袭作用机制。
1 资料与方法
1.1 细胞与试剂
SW480结肠癌细胞株购买自ATCC、DMED培养基及FBS购买自美国Gibco公司,Lipofectamine 2000转染试剂盒购买自Invitrogen公司,TRIzol试剂、RIPA裂解液、CCK8试剂盒、PCR荧光定量试剂盒、逆转录试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒及荧光素酶基因报告试剂盒购买自福麦斯生物科技有限公司,抗FoxM1、PCNA、cleaved-Caspase-3、MMP-9及MMP-2抗体均购买自密理博生物科技有限公司,过氧化物歧化酶标记鼠抗及兔抗菌购买自北京博奥生物科技有限公司。
1.2 细胞分组及转染
使用含有105的FBS完全培养基5 mL重悬SW480细胞,后转移至25 cm2细胞培养瓶中,并置于5%二氧化碳的37℃恒温培养箱中进行培养,在细胞长至80%后进行传代培养或进行干预处理。
收集对数生长期细胞并调整细胞密度至105个/mL的浓度并将其接种于12孔板中,将其分为SW480组、mimic对照组、miR-320 mimic-/FoxM1 wt+/FoxM1 mut-组、miR-320 mimic+/FoxM1 wt+/FoxM1 mut-组、miR-320 mimic-/FoxM1 wt-/FoxM1 mut+组、miR-320 mimic+/FoxM1 wt-/FoxM1 mut+组、miR-320 mimic组、pc-FoxM1组、miR-320 mimic+pc-FoxM1组。将细胞在培养板内继续培养24 h,后依照转染试剂盒说明书操作步骤对细胞进行转染干预,其中SW480组加入空白转染试剂,mimic对照组加入空白载体,miR-320 mimic组转染miR-320 mimic,pc-FoxM1转染pc-FoxM1,miR-320 mimic+pc-FoxM1组共转染miR-320 mimic和pc-FoxM1,4 h后进行换液处理将转染液换成正常细胞继续培养。
1.3 方法
使用qPCR法检测SW480组、mimic对照组、miR-320 mimic组中细胞miR-320及FoxM1表达水平,并每组检测3个复孔取均值。使用荧光素酶报告实验观察miR-320的FoxM1靶向关系,使用PCR扩增miR-320与FoxM1结合片段,并将其插入荧光素酶载体中,构建FoxM1野生质粒,构建集合片段中核苷酸突变的FoxM1突变质粒,后将miR-320与FoxM1野生质粒及突变质粒共转染如SW480细胞中并利用报告基因试剂盒检测荧光素酶活性。后使用CCK-8试剂盒检测各组细胞的增殖活性,并采用Western Blotting法检测各组细胞内FoxM1、PCNA、cleaved-Caspase-3、MMP-9及MMP-2蛋白水平,参照文献[8]采用划痕愈合实验及Transwell小室实验检测各组细胞迁移和侵袭能力。
1.4 统计学方法
使用SPSS20.0行统计学分析,计量资料采用均数±标准差(x±s)表示,多组间数据差异采用单因素方差法进行检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 miR-320靶向调控FoxM1表达
miR-320 mimic细胞表达miR-320量显著升高(P<0.05),FoxM1表达量显著降低(P<0.05),荧光素酶报告实验结果显示,与miR-320 mimic-/FoxM1wt+/FoxM1 mut-组相比,miR-320mimic+/FoxM1 wt+/FoxM1 mut-组荧光素酶活性显著降低(P<0.05),且对结合位点突变后结果显示其荧光素酶活性抑制作用消失,结果表明miR-320与FoxM1间存在靶向作用关系,见表1、2。
2.2 miR-320对SW480细胞增殖的影响
pc-FoxM1组细胞中FoxM1蛋白表达量显著升高(P<0.05),細胞转染4 d后miR-320 mimic组细胞增殖数及PCNA蛋白表达水平均显著降低(P<0.05),pc-FoxM1组细胞增殖数及PCNA蛋白表达水平均显著高于SW480组(P<0.05),miR-320 mimic+pc-FoxM1组细胞增殖数及PCNA蛋白表达水平均显著高于miR-320 mimic组(P<0.05),结果提示,miR-320可通过负向调控细胞中FoxM1的表达抑制细胞增殖,见表3、4。
2.3 miR-320诱导SW480细胞凋亡
miR-320 mimic组细胞凋亡率显著升高(P<0.05),pc-FoxM1组细胞凋亡率显著降低(P<0.05),且miR-320 mimic+pc-FoxM1组细胞凋亡率显著低于miR-320 mimic组(P<0.05)。蛋白水平检测结果显示,miR-320 mimic组细胞cleaved Caspase-9表达水平显著升高(P<0.05),pc-FoxM1组显著降低(P<0.05);且与miR-320 mimic组相比,miR-320 mimic+pc-FoxM1组细胞cleaved Caspase-9表达水平显著降低(P<0.05),结果提示,miR-320通过靶向调控FoxM1功能实现对SW480细胞凋亡的影响,见表5、6。
2.4 miR-320抑制SW480细胞迁移
miR-320 mimic组细胞迁移率显著降低(P<0.05),pc-FoxM1组细胞迁移率显著升高(P<0.05),且与miR-320 mimic组相比,miR-320 mimic+pc-FoxM1组细胞迁移率显著升高(P<0.05),结果提示,miR-320通过靶向FoxM1实现对SW480细胞迁移的调控,见表7。
2.5 miR-320抑制SW480细胞侵袭
miR-320 mimic组细胞侵袭数显著降低(P<0.05),pc-FoxM1组细胞侵袭数显著升高(P<0.05),且与miR-320 mimic组相比,miR-320 mimic+pc-FoxM1组细胞侵袭数显著升高(P<0.05),结果提示,miR-320通過靶向调控FoxM1实现对SW480细胞侵袭的影响,见表8。
3讨论
结直肠癌是现阶段我国临床中较为常见的恶性肿瘤之一,其临床发病率居高不下,有研究指出多数结肠癌患者在确诊后多已发展至中晚期,但近年来随着肠镜在临床中的普及,直肠癌的早期检出率明显提高,并有效降低患者的病死率。有学者指出,在结肠癌病灶组织中miR-320处于低表达状态,且在癌旁的正常黏膜组织中也呈现一定程度低表达状态[9]。结果均提示,miR-320的表达异常可能与结肠癌的发生及发展密切相关,并可作为评估患者病情的重要生物标志物之一。有研究指出,miR-320可通过调节细胞中c-Myc的表达进而有效抑制结肠癌细胞增殖活性[10]。本组研究结果显示,miR-320 mimic转染后SW480细胞的增殖速度明显降低,结果提示miR-320可有效调节肿瘤细胞增殖活性。
在miRNA发挥其调控肿瘤细胞增殖及生存过程中通过调节下游蛋白表达及活性是其重要的作用机制。有研究指出,FoxM1为保守性较高的膜受体,并在细胞的增殖、分化、凋亡等过程中起到十分重要的作用[11]。研究结果表明,miRNA可调节下游基因表达实现对细胞增殖的调控,进而对肿瘤的发生及发展造成不良影响[12]。miR-320低表达状态与多种骨髓瘤和实体瘤关系密切。但miR-320调控抑制肿瘤细胞增殖调控机制尚未完全揭示。本组研究结果显示,miR-320存在可与FoxM1结合序列,而在SW480细胞中存在明显的异常高表达状态,通过上调miR-320表达降低SW480细胞内FoxM1表达,结果表明miR-320可通过靶向调控FoxM1实现对肿瘤细胞进行影响。且荧光素酶报告基因检测结果显示,miR-320与FoxM1存在靶向调控关系。此外,有研究指出,miR-320的上调可有效促进肿瘤细胞增殖,且减弱miR-320可有效抑制结肠癌细胞增殖[13],结果提示miR-320可通过下调FoxM1水平而有效抑制SW480细胞增殖。
在肿瘤发展过程中细胞凋亡在其中扮演十分重要角色,miR-320可有效抑制多种肿瘤细胞凋亡,如乳腺癌、胰腺癌及肺癌等。有研究结果显示,miR-320可有效诱导结肠癌细胞凋亡,与本组研究结果相似[14]。研究显示,在肿瘤转移过程中,癌细胞的侵袭和迁移在其中扮演十分重要的作用,降低癌细胞的迁移和侵袭能力可抑制肿瘤转移[15-16]。
有学者研究指出,miR-320可显著抑制骨肉瘤、胶质瘤、乳腺癌等细胞的迁移和侵袭,并可能影响结肠癌细胞侵袭[17-18]。本研究显示miR-320异常高表达可有效抑制SW480的侵袭和迁移,并可有效抑制MMP-2和MMP-9的表达。pc-FoxM1可有效降低SW480细胞凋亡率,且FoxM1上调表达可显著减弱miR-320对肿瘤细胞凋亡诱导作用,结果提示miR-320可通过靶向调控FoxM1水平诱导肿瘤细胞凋亡。miR-320可显著抑制骨肉瘤、胶质瘤、乳腺癌等细胞的迁移和侵袭,并可能影响结肠癌细胞侵袭,与本研究结果相似[19-20]。本组研究结果显示,上调FoxM1表达可有效减弱miR-320 mimic对SW480细胞的迁移、侵袭及相关蛋白表达抑制作用,结果表明miR-320调控FoxM1表达与结肠癌SW480细胞的迁移和侵袭作用密切相关。结果表明,miR-320可有效抑制结肠癌SW480细胞迁移和侵袭,并可通过靶向抑制FoxM1实现对调控SW480的迁移和侵袭。
综上所述,miR-320通过靶向调控FoxM1实现抑制结肠癌SW480细胞增殖、侵袭能力。
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(收稿日期:2019-05-21)