LanCL1过表达对氧糖剥夺诱导PC12细胞凋亡及Sirt3-PGC-1α通路的影响

王御林 高元杰 钟纯正 王生成 王晓峰

(儋州市人民医院 1神经内科，海南 儋州 571700；2呼吸内科)

缺氧缺血性脑血管疾病占全部脑血管疾病的50%以上，脑部缺血缺氧易造成神经功能损伤引发脑卒中，是导致患者死亡和神经系统后遗症的主要原因之一〔1〕。目前缺血性脑损伤的病理机制尚不完全清除，已证实神经细胞凋亡是缺血性脑损伤的主要表现形式，对脑损伤范围及患者神经功能预后起决定性作用〔2,3〕。因此，研究神经细胞凋亡机制对临床治疗脑缺血性疾病具有重要意义。研究表明，人源硫化双丙氨酸环化酶样蛋白(LanCL)1在脑神经元中表达，受神经元活动诱导，是响应氧化应激并减轻神经元损伤所必需的元素，对神经细胞具有保护作用〔4〕。本研究以神经细胞株PC12细胞为研究对象，模拟氧糖剥夺(OGD)模式，分析OGD条件下PC12细胞中LanCL1的表达变化，探讨过表达LanCL1对PC12凋亡的影响及其保护神经细胞的可能作用途径。

1 材料与方法

1.1材料 PC12未分化细胞购于丰晖生物，DMEM培养基、胎牛血清、马血清和青霉素、链霉素购于美国Hyclone公司，磷脂结合蛋白(Annexin)V/碘化丙啶(PI)细胞凋亡检测试剂盒购于上海贝博生物，pcDNA3.1载体及pcDNA3.1-LanCL1合成于武汉伯远生物科技有限公司，四甲基偶氮唑蓝(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)购于美国Sigma公司，Lipofectamine2000转染试剂盒和Trizol试剂购于美国Invitrogen公司，互补脱氧核糖核酸(cDNA)合成试剂盒和实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒购于美国Sigma公司，放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液购于北京索莱宝科技有限公司，沉默调节蛋白(Sirt)3抗体一抗、过氧化物酶体增殖活化受体γ共激活因子(PGC)-1α抗体一抗、LanCL1抗体、辣根过氧化物标记的羊抗兔二抗购于武汉艾美捷科技有限公司。FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)，VeritiTMPCR仪(美国Thermo Scientific公司)，7500实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)，二氧化碳(CO2)培养箱(德国Binder公司)，Multiskan Sky全波长酶标仪(美国Thermo Scientific公司)。

1.2细胞培养 将PC12细胞置于含有5%胎牛血清、10%马血清、1%青霉素和链霉素的DMEM培养基中，放于5%CO2、37℃恒温培养箱中培养。2 d后进行传代，取细胞密度5×105个/ml接种，每2～3 d换液一次，待细胞密度至(2～4)×106个/ml时进行第2次传代。使用神经生长因子(NGF)50 ng/ml处理第2代对数生长期细胞，促进细胞分化。

1.3细胞分组 将细胞分为4组，对照组为正常培养的PC12细胞；OGD组将PC12细胞接种于无血清DMEM培养基，置于5%CO2、37℃恒温培养箱中培养6～8 h后，转入加血清培养基中继续培养；pcDNA3.1组为将pcDNA3.1空载体转染至PC12细胞(转染方法参照试剂盒说明书进行)，并将细胞接种于无血清DMEM培养基，置于5%CO2、37℃恒温培养箱中培养6～8 h后，转入加血清培养基中继续培养；pcLanCL1组为将pcDNA3.1-LanCL1转染至PC12细胞，并将细胞接种于无血清DMEM培养基，置于5%CO2、37℃恒温培养箱中培养6～8 h后，转入加血清培养基中继续培养。

1.4RT-PCR检测LanCL1 mRNA表达 采用Trizol试剂分别提取对照组和OGD组培养6 h、12 h、24 h、48 h细胞总RNA，使用cDNA合成试剂盒合成cDNA，稀释cDNA为统一浓度，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参，RT-PCR检测LanCL1 mRNA相对表达量，RT-PCR体系参照定量RT-PCR试剂盒，模板量为1 μl，程序：95℃ 2 min；95℃ 1 min；55℃ 2 min，共40个循环。LanCL1引物序列：正向5′-CCTTCAGGTGAACCAAGGAA-3′，反向5′-AGATCACGTCAGCACACTGC-3′；GAPDH引物序列：正向5′-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3′，反向5′-TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT-3′。同时检测pcDNA3.1组和pcLanCL1组细胞培养24 h时LanCL1 mRNA相对表达量，相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。

1.5MTT实验检测细胞生存率 收集各组细胞，以1×104个/孔接种于96孔板，按每组的培养条件继续培养24 h后，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，避光培养4 h。倒掉培养基，每孔加入200 μl DMSO，震荡混匀1 min，在酶标仪上测定570 nm处吸光度。

1.6流式细胞仪检测细胞凋亡 收集各组细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗1次，离心弃PBS后，加入PBS重悬细胞，过滤，弃PBS。加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的Annexin V和PI染色液，避光染色30 min，在流式细胞仪上检测细胞凋亡情况。

1.7Western印迹检测LanCL1、Sirt3和PGC-1α蛋白表达 收集1.3中各组培养6、12、24、48 h后的细胞，使用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离目的条带后，转至纤维素膜(转膜过程中带上干净的无菌手套，避免污染及损坏薄膜)，封闭2 h后，分别加入稀释过的LanCL1抗体、Sirt3抗体和PGC-1α抗体一抗，4℃过夜孵育，然后加入稀释的辣根过氧化物标记的羊抗兔二抗，继续孵育2 h，抗体稀释比例参照说明书。加入显色剂显色后，放入Kodak数字成像系统进行扫描，并采用Image J软件分析目的条带灰度值，以β-actin为内参，计算目的蛋白相对表达量。

1.8统计学分析 采用SPSS22.0软件进行χ2检验、独立样本t检验。

2 结 果

2.1LanCL1在OGD PC12细胞中表达降低 与对照组PC12细胞相比，OGD组PC12细胞中LanCL1 mRNA和蛋白表达量均显著低于对照组(P<0.05)，见表1、图1。

表1 两组各时间点PC12细胞中LanCL1 mRNA及蛋白的表达水平

与对照组比较，1)P<0.05

图1 两组PC12细胞中LanCL1蛋白表达

2.2LanCL1过表达促进OGD PC12细胞存活 对照组、OGD组、pcDNA3.1组和pcLanCL1组LanCL1 mRNA相对表达量分别是1.86±0.41、0.79±0.24、0.70±0.17、1.81±0.39，pcLanCL1组细胞中LanCL1 mRNA相对表达量显著高于OGD组和pcDNA3.1组(P<0.05)，说明细胞转染实验成功。OGD组和pcDNA3.1组细胞存活率〔(45.38±9.42)%、(44.46±10.83)%〕显著低于对照组〔(95.67±17.23)%，P<0.05〕；pcLanCL1组细胞存活率〔(88.94±15.27)%〕较OGD组和pcDNA3.1组显著升高(P<0.05)，与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，说明过表达LanCL1促进OGD条件下PC12细胞生存。

2.3LanCL1过表达抑制OGD诱导的PC12细胞凋亡 OGD组、pcDNA3.1组和pcLanCL1组细胞凋亡率〔(46.83±10.74)%、(45.33±9.86)%、(21.19±3.68)%〕均显著高于对照组〔(13.37±2.51)%,P<0.05〕，pcDNA3.1组细胞凋亡率与OGD组比较差异无统计学意义(P>0.05)，pcLanCL1组细胞凋亡率显著低于OGD组(P<0.05)，说明LanCL1过表达抑制OGD诱导的PC12细胞凋亡。见图2。

图2 流式细胞仪检测各组细胞凋亡

2.4LanCL1过表达促进OGD PC12细胞中Sirt3、PGC-1α蛋白表达 OGD组和pcDNA3.1组细胞中Sirt3、PGC-1α蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)，均显著低于对照组(P<0.05)；pcLanCL1组细胞中Sirt3、PGC-1α蛋白相对表达量均显著高于OGD组和pcDNA3.1组(P<0.05)，与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。说明LanCL1过表达能够促进OGD PC12细胞中Sirt3、PGC-1α蛋白表达。见图3，表2。

1～4：对照组、OGD组、pcDNA3.1组、pcLanCL1组图3 各组细胞中Sirt3、PGC-1α蛋白表达水平

组别Sirt3PGC-1α对照组1.24±0.391.19±0.28OGD组0.62±0.251)2)0.61±0.231)2)pcDNA3.1组0.61±0.221)2)0.59±0.181)2)pcLanCL1组1.08±0.351.03±0.32

与对照组比较：1)P<0.05；与pcLanCL1组比较，2)P<0.05

3 讨 论

近年来，虽然脑缺血缺氧引起的脑卒中死亡率有所下降，但脑卒中仍是全球人类死亡和残疾的主要原因〔5〕。目前，组织型纤溶酶原激活剂是唯一获得食品药品监督管理局批准的用于治疗急性缺血性脑卒中的治疗药物，因此神经保护药物的研发和应用对脑卒中患者具有重要意义。LanCL1是LanC样蛋白家族成员，以往研究证实LanCL1能特异性结合还原型谷胱甘肽(GSH)，参与氧化还原调节〔6〕。近年来动物模型实验表明，LanCL1蛋白在脑、脊髓中高表达，表现出受神经元活动调节，并且在神经元抗氧化活性中起关键作用〔7〕。本研究说明LanCL1在神经细胞损伤保护中起作用。此外，本研究还通过检测Sirt3-PGC-1α通路阐述了LanCL1保护神经细胞的可能潜在机制。

Sirt3是NAD+依赖性蛋白质脱乙酰酶，主要定位在线粒体，是线粒体功能调节因子，在抗细胞凋亡和抗氧化应激中发挥重要作用〔8,9〕。研究报道，Sirt3在衰老、神经退行性疾病和抗逆性中可以预防神经紊乱，起到神经保护作用，且Sirt3的激活可以介导各种保护剂对脑卒中的有益作用〔10,11〕。本研究与Xie等〔12〕研究结果相似。Sirt3抑制细胞凋亡的作用主要有：①可直接调节线粒体通透性转换孔关闭，抑制促凋亡蛋白释放而降低细胞凋亡率〔13〕；②Sirt3也可通过清除氧自由基抑制氧化应激引起的细胞凋亡〔14〕；③通过抑制c-Jun氨基末端激酶的磷酸化或通过去乙酰化P53激活抗凋亡途径而抑制细胞凋亡〔15〕。提示过表达LanCL1可能通过诱导Sirt3表达升高降低OGD诱导的PC12细胞死亡。

PGC-1α是一种转录共激活因子，在调节大脑等线粒体生物合成和能量代谢中起关键作用〔16,17〕。Wang等〔18〕研究表明，敲除Sirt3加剧OGD诱导的PC12细胞损伤，而过表达Sirt3可以保护OGD诱导的PC12细胞死亡，其保护作用依赖于PGC-1α和锰超氧化物歧化酶。研究报道，PGC-1α-Sirt3途径可通过直接去乙酰化和三磷酸腺苷(ATP)中的ATP合酶β来预防神经元细胞凋亡〔19,20〕。本研究提示LanCL1对保护OGD诱导的PC12细胞的保护作用可能与PGC-1α-Sirt3途径密切相关，过表达LanCL1能够通过Sirt3-PGC-1α信号途径保护OGD诱导的PC12细胞凋亡。

本研究初步分析LanCL1在OGD条件下PC12细胞中的表达作用及其可能作用机制，后期将会继续验证其神经元保护作用，为临床治疗脑缺血缺氧性疾病提供理论参考和新的治疗靶点。