川崎病内皮细胞模型及其发病机制研究进展

郑小兰 张 怡

川崎病(Kawasaki disease，KD)是一种以全身中小动脉血管炎为主要病变的急性发热出疹性疾病，主要发生于6个月～5岁儿童。自1967年川崎富作首次报道以来，全世界均有报道，近年来其发生率呈逐年升高趋势[1]。KD可并发冠状动脉损伤(coronary artery lesion，CAL)，目前已是发达国家儿童获得性心脏病的首要发病原因[2]。既往研究认为CAL始于血管内皮细胞调控紊乱[3]。因此，建立合适的KD内皮细胞系模型，是探索KD及其CAL发病机制、预防及治疗的重要基础。目前国内外已建立的KD内皮细胞模型主要有人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)与人冠状动脉内皮细胞(human coronary artery endothelial cells，HCAEC)。本文系统介绍了KD体外研究的内皮细胞模型及其在发病机制上的研究进展。

一、人脐静脉内皮细胞

自Jaffe等1973年首次培养了HUVEC以来，HUVEC就广泛用于血管内皮细胞病变的研究[4]。Jiang等[5]发现KD患儿血清中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平明显升高，TNF-α能同时诱导HUVEC凋亡并抑制其扩散，是一种重要炎性因子。TNF-α主要由巨噬细胞和单核细胞产生，生物学活性广泛，可参与调节免疫功能、抑制肿瘤细胞、介导炎性反应及组织损伤等病理生理过程[6]。Inoue等[7]分别用急性期与恢复期KD患儿血清孵育HUVEC，发现急性期KD血清刺激HUVEC后其TNF-α水平升高，且细胞间黏附因子-1(ICAM-1)表达增加，表明KD分泌TNF-α可诱导ICAM-1表达，参与KD发生、发展。Kaneko等[8]以TNF-α处理后的HUVEC为炎性内皮细胞模型，使用重组表达cDNA克隆的血清学分析技术，对4个恢复期KD患儿血清进行免疫筛选鉴定了46个抗原，这些抗原在5个非KD患儿血清中几乎没有发现，为了解KD发病机制提供了线索。

microRNA(miRNA)为长度约22nt的内源性短链单链RNA分子，属于非编码RNA，既往认为非编码RNA没有生物学功能，近年来研究发现miRNA可通过与编码蛋白质mRNA互补结合，参与调控细胞的增殖、迁移和凋亡等一系列过程，在血管生成和病变以及心血管疾病等过程中可发挥重要作用[9]。2013年Shimizu等[10]首次用小RNA测序技术发现miRNA-145可能参与调控KD急性期的转化生长因子-β通路调节基因的表达，提示了miRNA可能在KD发病过程中发挥作用。Ni等[11]研究发现，急性期KD中miR-155/SOCS1信号通路的激活和miR-31表达水平的升高，可能导致调节性T细胞下降，进而致免疫系统功能紊乱。He等[12]用 KD患儿血清刺激HUVEC后，发现HUVEC表达的miR-483降低，结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)及内皮间质转化(endothlial-mesenchymal transition，EndoMT)标记增加。分析发现miR-483可被Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4，KLF4)激活，KD血清可抑制KLF4-miR-483轴，导致CTGF表达增加、EndoMT水平升高，最终引起CAL；他汀类药物可恢复KLF4-miR-483轴的表达，可能对急性KD患儿起到一定的治疗作用。Wu等[13]研究发现miR-186在急性KD患儿血清中上调，影响SMAD6的表达，调节TGF-β/MAPK信号通路，诱导了HUVEC损伤，提示miR-186可作为KD药物治疗靶点。近年来，KD血清中各种具有不同作用的miRNA不断被发现，已成为KD研究的热点和前沿，表明miRNA在KD生物标志物或治疗靶点研究方面有重要价值。

内皮微粒(endothelial microparticle，EMP)是血管内皮细胞在激活或凋亡状态下所释放的微小囊泡状物质，直径约0.1～1.0μm。EMP为一种用于交换生物信号的细胞间的传递系统，在炎症、凝血和血管功能调节方面均有一定作用，被认为是内皮细胞受损的标志，其测定已被认为是评价内皮损伤的方法[14]。Nakaoka等[15]用流式细胞仪检测到KD急性期患儿血清中EMP明显升高，且并发CAL的患儿EMP比无CAL的患儿升高更明显，经过初始IVIG治疗后EMP明显下降，用miRNA微阵列分析发现有两个特殊miRNA，hsa-miR-145-5p和hsa-miR-320a封装于EMP中，同时发现这两个miRNA杂交信号可以在CAL患儿内皮细胞中检测到，提示miRNA可被封装于EMP，然后从内皮细胞释放入管腔中，表明EMP定量分析有成为KD生物标志物的潜在可能性。Tian等[16]用TNF-α刺激HUVEC后，发现内皮细胞形态发生显著变化，流式细胞仪分析细胞上清液发现EMP水平明显升高，内皮细胞形态发生显著变化，并分泌大量微粒子；由于既往研究已证实TNF-α参与了KD发病，故可认为EMP在KD血管内皮细胞损伤中可能起着重要作用[8]。

由于HUVEC具有分化潜能和新生血管内皮细胞特性，可通过新生儿脐带消化所得，获取容易，所以目前对内皮细胞功能的了解大部分是基于HUVEC的研究[17]。但HUVEC平均寿命为传代10次，可培养约5个月，故用HUVEC做长期体外实验是不可能的[18]。由于供者来源不同，故分离培养的HUVEC所得实验结果相互之间并没有可比性。McCall等[19]对人不同类型的血管内皮细胞进行miRNA分析后发现不同类型内皮细胞miRNA表达不一致。KD患儿心血管并发症主要发生在冠状动脉，与HUVEC在基因表达、血流动力学、功能等方面存在差异，故基于HUVEC研究的KD实验结果仍存在争议，但Krishnaswamy等[20]用RT-PCR检测TNF-α刺激HCAEC和HUVEC后分泌的细胞因子，发现没有明显差别，提示目前基于HUVEC进行的KD体外研究仍具有非常重要的意义，值得进一步研究。

二、人冠状动脉内皮细胞

HCAEC对研究和了解冠状动脉疾病的分子机制有重要价值，Krishnaswamy等[20]首次报道了HCAEC多功能性细胞因子的表达，及其在炎性因子和糖皮质激素调控下的变化，比较了来自HCAEC和HUVEC的细胞系中细胞因子转录的表达，发现HCAEC中白细胞介素-5(interleukin-5，IL-5)、IL-6、IL-8和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达上调；TNF-α刺激HCAEC后能诱导其表达IL-1α、IL-6、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和MCP-1；HCAEC与HUVEC表达的细胞因子的基因分布没有明显的差异，糖皮质激素能抑制这两种细胞表达IL-8。这些研究表明HCAEC能够表达多种多功能的细胞因子，可能与血管炎症有关。有研究者[21]提取KD患儿外周血单核细胞(PBMC)进行培养，发现其上清液TNF-α含量明显高于非KD患儿组，用此上清液刺激HCACE后发现IL-6、IL-1β、NF-κB p65及半胱天冬酶-6表达上调，且可诱导HCAEC细胞凋亡，同时发现NF-κB抑制剂可明显减轻上述反应，提示KD患儿血管炎的发病机制与NF-κB信号通路有关，这与以HUVEC为模型进行的研究结论相符[22]。

维生素D是一种固醇类衍生物及类固醇激素，也是人体必需的脂溶性维生素，其在血液中的最强活性形式为1,25二羟维生素D[1,25-(OH)2D3]，多项研究表明维生素D缺乏与心血管疾病发生有潜在相关性[23]。Kudo等[24]用1,25-(OH)2D3预处理HCAEC，可抑制TNF-α诱导的血管细胞黏附因子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)表达和IL-8产生，调节炎性反应。Suzuki等[25]用1,25-(OH)2D3预处理HCAEC，发现1,25-(OH)2D3可抑制TNF-α诱导NF-κB活化和E选择素分泌，调节KD血管炎性反应，提示维生素D可能有治疗KD血管炎症的潜在价值。

由于制备HCAEC所需的冠状动脉标本获取困难，故目前绝大多数研究所用细胞是直接向生物公司购买所得。田凤石等[26]在成年男性猝死半小时内的心脏里提取HCAEC，在国内首先建立了成人冠状动脉内皮细胞的体外培养方法。由于KD发病主要为5岁以下儿童，成人冠状动脉与儿童冠状动脉存在差异，若能以相似方法得到KD患儿的冠状动脉内皮细胞并将其用于KD研究，则会使实验结果更有价值；但不可否认的是，目前基于HCAEC的KD研究仍具有重要意义。

三、其 他

目前KD研究的体外模型所使用的内皮细胞以HUVEC与HCAEC为主。研究者仍在不断探索新的内皮细胞模型，Donnini等[27]首次建立了一种新型人类主动脉内皮细胞(human aortic endothelial cells，HAEC)增殖的长期培养系统。此类HAEC可在体外保持多代不同的分化特征，产生抗血栓因子和血栓形成因子，并对TNF-α刺激产生炎性反应，在表面表达ICAM-1，产生大量NO、ET和细胞因子，从而改变生长特性，此新系统可能对理解和研究许多血管病变的分子机制和老化过程非常有用。KD并发症以冠状动脉为主，而主动脉造并未受到明显损伤，提示将HAEC模型用于KD发病机制的比较研究有重要价值。

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)是一种由自身体细胞通过去分化、重编程后诱导出的类胚胎干细胞样细胞，较普通成体干细胞有更高的全能性。自2006年日本科学家山中伸弥利用Oct3/4、Sox2、c-Myc 和Klf4 4种转录因子成功诱导出iPSC以来，iPSC技术不断发展。2017年Ikeda等[28]分别将IVIG抵抗型与IVIG反应型KD患儿的皮肤成纤维细胞通过基因技术诱导出iPSC，并使其分化为血管内皮细胞(iPSC-ECs)；对iPSC-ECs进行RNA测序后发现，CXCL12表达在源自IVIG抵抗型患儿的iPSC-ECs中明显上调，参与IL-6信号的基因组表达上调，提示这些基因与KD发病相关，此研究是研究者首次建立iPSC模型对KD进行体外研究，为后续研究提供了新思路，但iPSC的诱导率低、有癌变、技术尚不成熟等都是需要解决的问题。

综上所述，KD自发现以来，众多研究对本病进行了大量实验室研究和临床观察，KD发病机制至今尚不明确，但越来越多基于内皮细胞模型的KD体外研究为其发病机制提供了重要线索。目前用于KD研究的内皮细胞模型都有各自的优缺点，随着科技进步，特别是iPSC技术的发展，有望克服当前困难，建立一种新的KD体外研究的内皮细胞模型，但需要强调的是，目前实验常用的HUVEC与HCAEC模型仍具有不可替代的价值。