钙调磷酸酶抑制剂环孢素A和他克莫司药效的监测方法进展

姚 婧，林榆杰

泰州市人民医院，泰州225300

免疫抑制治疗是器官移植术后抗排斥反应的重要措施。钙调磷酸酶抑制剂（Calcineurin inhibitors，CNIs）环孢素A（Ciclosporin A，CsA）和他克莫司（Tacrolimus，Tac）是器官移植术后最常用的免疫治疗药物，其应用大大降低了移植术后排斥反应的发生，提高了移植器官的生存率[1]。

尽管CNIs是移植药物史上的重大发现，但是CNIs的治疗窗窄，药物代谢参数和药效的个体差异大，长期应用易产生毒副作用，如神经系统毒性、移植后肿瘤以及各种代谢疾病。临床上CNIs的剂量调整主要是使用治疗药物监测（Treatment drug monitoring，TDM），监测CNIs谷浓度结合患者临床症状进行，但这种方法无法确定初始治疗剂量，无法准确监测患者实时药效。为此，研究者不断寻找更多的药效靶标，来评价CNIs的免疫抑制效果，以辅助CNIs的个体化给药。本文就目前常用的CNIs药效监测方法作一综述。

1 非特异性测定

CNIs药效的测定方法可分为非特异性测定和特异性测定。非特异性的药效参数是通用的，用于反映移植术后免疫系统的总体活性。优点之一就是可以评估临床联合用药时机体的整体免疫状态。常见的非特异性药效靶标有：T细胞增殖水平、T细胞表面抗原、T细胞亚群、CD4+中ATP水平、抗HLA（human leukocyte antigen，人类白细胞抗原）抗体以及可溶性CD30（soluble CD30，sCD30）等。

目前临床应用的大部分免疫抑制剂都是通过抑制淋巴细胞增殖发挥作用。Barten MJ等[2]通过流式细胞术测定刺激后全血或PBMCs（peripheral blood mononuclear cells，外周血单个核细胞）中淋巴细胞的扩增，来比较不同浓度下CsA或Tac与霉酚酸酯联用时免疫抑制效果。Kurata Y等[3]使用基于羧基二乙酸酯琥珀酰亚胺酯（Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE）的方法，测定66例服用CsA的肾移植患者的T细胞增殖水平，发现患者临床表现如不良事件的发生与T细胞增殖的百分比有较好的相关性。

此外，Barten MJ等[2]还观察到各免疫抑制剂联用时增殖细 胞 核 抗 原 （Proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、CD25、CD95或CD154等表达抑制增强。Stalder M等[4]通过流式细胞仪测定淋巴细胞增殖及淋巴细胞表面抗原CD25、CD71和CD154的表达，监测肾移植患者的免疫状态。

同时，T细胞亚群的分化是评估机体免疫状态的常用方法。移植术后患者CD4+T细胞绝对计数过低易引起严重感染，而CD4+/CD8+过高则易导致排异反应的发生[5]。刘伟等[6]联合检测肝移植术后患者的CD4+T细胞ATP水平和T淋巴细胞亚群，发现排异组受者外周血CD3+、CD4+T淋巴细胞百分比及CD4/CD8均明显升高。Martínez C等[7]测定异基因造血细胞移植术后的药效学指标，发现CD4+T细胞ATP水平的升高、CD8+T细胞升高及CD8+Treg细胞的降低与移植物抗宿主病显著相关。

采用ImmuKnow技术检测CD4+T细胞ATP水平，可以快速评估细胞的免疫功能。多项研究显示，发生感染时，ATP浓度明显下降，感染控制后恢复至感染前水平；发生排斥时，浓度升高，排斥控制后ATP浓度降至排斥前水平[6，8-10]。

Amirzargar MA等[11]认为，移植术后早期监测HLA抗体、sCD30等生物标记物有利于监测肾移植后免疫反应。由供体特异性HLA抗体（donor-specific human leukocyte antigen antibodies，DSA）引起的抗体介导的同种异体移植物损伤最近被认为是晚期移植物丢失的主要原因之一[12]。CNIs的应用有利于阻止DSA的免疫学作用[13]。

sCD30被认为是反映机体免疫是否处于活化状态的靶标，可指示急性排斥反应的发生[11，14]。研究证明，移植前后可溶性CD30的提高与急性排斥反应的发生和不良术后有关[15]。

综上，这些非特异性的靶标并不仅仅针对CNIs的药效，它们反映的是机体的总体免疫状态或细胞的免疫功能。这些靶标的测定有利于监测移植术后患者免疫抑制治疗的药效，促进CNIs的个体化用药。

2 特异性测定

药物的药理作用决定了该药物的药效特异性监测方法。对于CNIs，它主要是通过抑制T淋巴细胞内的钙调磷酸酶（Calcineurin，CaN）活性而发挥作用。CaN活性的下调抑制了NFAT（Nuclear factor of activated T-cells，活化T细胞核因子）的去磷酸化，使NFAT无法进入细胞核，从而使NFAT下游基因（如白介素-2、干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α等）的转录和表达被抑制，产生免疫抑制作用。CNIs药效通路上其主要的特异性药效参数包括：CaN活性、NFAT核转位、细胞因子释放水平和细胞因子基因表达等。

2.1 CaN活性的直接测定

传统的测定CaN活性的方法有：32P标记肽的放射性同位素法、分光光度法、液相色谱法等。

Koefoed-Nielsen PB等[16]通过测定32P标记肽的放射性同位素法测定CaN活性，发现淋巴细胞中CaN活性的抑制程度与CsA血药浓度呈负相关。同时也发现Tac和CsA产生的CaN活性抑制效果个体差异性较大。因此，CNIs的药效测定对于了解CsA和Tac的个体敏感性是很有必要的。

Sanquer S等[17]通过分光光度法评估肺移植后最初2年内CaN的活性，发现当酶活性高于102 pmol·mg-1·min-1的上限或低于12 pmol·mg-1·min-1的下限时，排斥的风险更高。

Carr L等[18]建立了一种液相色谱-多反应监测质谱法（Liquid Chromatography-TandemMass Spectrometry，LCMRM-MS），通过测量合成的磷酸肽底物的去磷酸化来量化CaN活性。该方法适用于常规临床剂量的药物，有望于大规模用于临床，以检测CNIs治疗患者的CaN活性。

2.2 NFAT核转位测定

NFAT是参与调节免疫应答的转录因子家族。对NFAT核转位的抑制是CNIs药效通路上的重要一环。Maguire O等[19]通过使用流式细胞仪的图像分析系统，定量测定CD4+和CD8+T细胞中的NFAT1核转位来评估NFAT的激活效应，从而确定他克莫司介导的抑制效应。体外实验证实，他克莫司对NFAT1核转位的抑制有剂量依赖性，体内实验（n=3）也发现，患者血浆和CD4+中的Tac浓度均与NFAT1核转位的变化相反。这些均表明NFAT1核转位可作为监测Tac药效的生物靶标。

2.3 细胞因子释放水平测定

CNIs通过抑制白介素-2（Interleukin-2，IL-2）、干扰素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor，TNF-α）等细胞因子的表达水平来抑制免疫反应。可通过测定移植后患者血清或刺激之后PBMCs中的细胞因子水平，用来作为衡量CNIs药效的间接指标。Barten MJ等[20]发现，CNIs的血药浓度水平与IL-2的产生紧密相关。然而，由于不同细胞所处周期不同，细胞因子的生存半衰期不同以及细胞因子表达上调、下调的变化，监测细胞因子产生有一定的困难。

2.4 细胞因子mRNA表达测定

考虑到直接测定细胞因子水平的缺陷，研究人员通过测定细胞因子的mRNA表达来评估CNIs的免疫抑制效果。

Ha¨rtel C等[21]采用RT-PCR（Reverse Transcription PCR，逆转录PCR）测定全血中细胞因子的mRNA表达，用于监测CsA的药效。研究者发现，T细胞刺激后TNF-α的mRNA表达增加且代谢延缓，这表明炎症因子mRNA表达的变化有望成为CsA个体效应的敏感指标。该研究团队同时还测定了全血中IL-2 mRNA的表达，发现Tac单一疗法的患者IL-2 mRNA表达可能与移植术后排斥相关[22]。

德国海德堡大学的Sommer C团队建立了一种通过RT-PCR测定NFAT下游基因的表达水平，监测移植患者CNIs药效的方法[23]。在体外实验中，在CsA剂量为20 ng·mL-1和200 ng·mL-1时，测定经刺激后的PBMCs中NFAT各下游基因的mRNA表达，发现IL-2、IFN-γ和GM-CSF（Granulocyte-macrophagecolony-stimulating factor，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子）三种细胞因子的mRNA表达变化最为敏感。进一步研究发现，每位个体患者的NFAT下游基因（IL-2，IFN-γ和GM-CSF）的相对表达（Residual gene expression，RGE）相互关联[24]。RGE与CSA或Tac的剂量间有高度的个体间差异。相反，在治疗方案稳定的情况下，RGE的个体内差异性相对较小。

3 CNI药效监测的临床研究

尽管越来越多的CNIs药效监测方法在不断出现，但至今为止未有一种方法大规模用于临床常规监测。临床研究已经证实CNIs药物浓度和CaN的活性之间的关系，但关于CaN活性与移植后临床结局之间的关系研究仍然较少。在器官移植排斥中，CaN的活性与肝移植术后的临床结局有关[25]。在长达两年随访中，Sanque S等[17]发现在肺移植患者（N=107）中CaN的活性与急性和慢性排斥反应有关。

临床实验中，Sommer C团队以NFAT下游基因（IL-2、IFN-γ和GM-CSF）的相对表达监测CsA和Tac的药效，发现NFAT RGE可以有效地指示移植术后患者AR及感染并发症的发生[23，26，27]。通过监测CsA谷浓度水平和NFAT RGE可以评估老年患者肾移植术后的心血管风险、肾功能和其它副作用，如感染、恶性肿瘤[27]等。同样，通过NFAT下游基因监测Tac药效可以指示肾移植患者感染并发症的发生[28]。前瞻性临床试验（n=22）也证实，监测NFAT下游基因表达可以作为肝移植术后检测CNIs药效的一种可靠措施[29]。此外，一项关于CsA的大型前瞻性随机干预试验正在进行，该项研究是第一个评估稳定肾移植患者免疫检测方法、优化免疫抑制效果的随机对照研究。

4 结论和展望

虽然目前的CNIs的药效测定方法多数仍停留在实验室阶段，到真正应用于临床实践还有一段距离；但不可否认的是，CNIs药效的测定为了解生物效应和免疫抑制程度提供了一种新策略，有助于评估CNIs药物效应。在未来，CNIs药效的测定有望成为辅助TDM、优化CNIs个体化给药的新措施。