清热药抗呼吸道合胞病毒的研究进展

马元荣，孙铁锋，王平,4，杜海涛，张恒龙

(1.山东中医药大学药学院，山东 济南 250355；2.长清区平安街道社区卫生服务中心，山东 济南 250300；3.山东省中医药研究院，山东 济南 250014；4.天津大学精密测试技术及仪器国家重点实验室，天津 300072；5.山东东营胜利油田中心医院放射科，山东 东营 257000)

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)是一种有胞膜的单股负链RNA 病毒，属副粘病毒科肺炎病毒属，RSV传染性极强。主要是通过空气飞沫和密切接触传播。多见于新生儿和 6 个月以内的婴儿。3～7 日，是导致幼儿急性下呼吸道疾病(LRTI)和住院的主要病原体[1],严重时可导致呼吸衰竭甚至死亡。RSV 感染已被列为全球性公共卫生问题。RSV易侵犯体弱和年老的人群，全球每年3 380万5 岁以下的儿童因感染RSV患病，其中340万患儿因急性下呼吸道感染需要住院治疗[2-4]，约92万例5岁以下儿童死于继发性肺炎,占所有死亡例数的15%[5];美国RSV感染引起 78%的死亡是65岁以上的老人,直接导致心脏衰竭和继发性细菌性肺炎[6]。目前临床没有治疗 RSV 感染的特效药，常用的抗病毒药物为利巴韦林(Ribavirin，俗称病毒唑)，其具有广谱性、毒副作用大、耐药性强，近年临床应用呈下降趋势[7]；纯化合物新药的开发难度大、周期长、费用高,且化学药物存在毒副作用大、易产生抗药性等问题。疫苗还处于临床试验阶段，没有许可上市。中医药2 000 多年的医治病毒性疾病的宝贵经验。近年来，国内外研究者已从中药中筛选出了大量抗病毒药物，在临床上的应用也越来越多。因此探寻新的具有抗RSV 活性的药物具有重要意义。

清热药是以清解里热为主要作用的药物,其能清解里热、治疗五脏各种热性疾病。药性多为寒凉，少数平而偏凉，味多苦，或甘，或辛，或咸。多入肺、胃、心、肝、大肠经[8]；有效成分为生物碱、黄酮类、苷类、挥发油、酚类等化合物,其中的苷类和黄酮类具有抗菌、抗病毒、增强机体免疫力的作用[9],临床上主要用于热病高热、痢疾、痈肿疮毒、目赤肿痛、咽喉肿痛等各种里热证候。因药性及适应证的不同，可分为清热泻火药、清热燥湿药、清热凉血药、清热解毒药和清虚热药5类。清热泻火药常用于医治气分热证和脏器火热证，功效表述为“清气分热、清肺热、清胃热；清热燥湿药除湿热，常用来医治各种湿热证；清热凉血药有清解营分、血分热邪之功效；清热解毒药具有清解火热毒邪作用，以 “解毒”为主“清热”为辅，主用于实火热毒所致的病症；清虚热药能清虚热、退骨蒸，主用于午后潮热，低热不退等症。本文从清热药的抗RSV西药局限性、药理作用、抗RSV病机制、抗 RSV 药物的筛选思路等方面进行综述,为下一步从清热药类中筛选抗RSV特效中药提供一些新思路。

1 目前抗 RSV 药物的局限性

目前美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于预防和治疗 RSV 感染的药物是吸入型利巴韦林和帕利珠单抗，但是这两种药物主要用于 RSV 感染的高风险患者，其效果仍存在异议[10-11]。

利巴韦林(Ribavirin)是人工合成的核苷类抗病毒药，该药的抗病毒机制是抑制RSV的复制,同时可以启动AKT-NF-κB途径、增加Bcl-2、减少Bax 蛋白表达,从而抑制RSV感染诱导的 A549 细胞初期凋亡[12]，但对病毒无直接灭活作用。它是唯一获准用来治疗RSV引发的下呼吸道感染住院患者的抗病毒药物，但仍有其局限性，如价格昂贵、治疗效果欠佳，且不良反应较多，尤其是在大剂量、长时间应用利巴韦林注射剂治疗病毒性感染时，会出现可逆性贫血，白细胞数量减少，肝功能异常以及肠胃功能下降等，其作为抗病毒药物，在使用上受到了很大的限制。但停药后可恢复[13]。

帕利珠单抗(palivizumab)是一种IgG1型的RSV中和单克隆抗体，作用靶点是F蛋白抗原位点Ⅱ的保守表位，抑制F蛋白介导的细胞融合。在发达国家能明显降低高危儿童RSV感染住院率但成本费用昂贵，96%的儿童RSV流行发生在发展中国家，他们难以负担帕利珠单抗的高额费用[14]。

疫苗可以有效地预防病毒感染。RSV中F蛋白是单克隆抗体药物及疫苗研制的主要对象[15]。为了有效预防RSV感染性疾病发生,人们一直在研制RSV疫苗,尤其现在对RSV免疫学有了更深研究，再加上新型疫苗技术的介入我们研发了一些适用于不同人群的疫苗，如儿童、孕妇或者体弱老人，曾先后有减毒活疫苗、亚单位疫苗、载体疫苗和纳米颗粒疫苗等问世,但仍没有疫苗获得许可上市[16]。RSV 的流行具有明显的气候、季节分布特征,又称为季节性流行病毒，其表面抗原变异性强，不同的流行季节可能出现多种 RSV亚型，并且基因型相互转变，随时发生新的取代旧型基因型，导致RSV重复感染[17-18]。现有的RSV疫苗的免疫原型差，RSV的非结构蛋白可通过抑制Ⅰ型干扰素分泌、影响树突细胞成熟和 T 细胞反应、下调 STAT2 表达等方式抑制自燃免疫和适应性免疫，干扰疫苗效果[19]。

2 清热药与抗病毒相关的药理作用

机体感染 RSV 后，RSV 作为外源性致热原与呼吸道上皮组织细胞表面的TLRs 结合,激活细胞产生和释放内生致热原(endogenous pyrogen,EP),如白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等，IL-8、TNF等通过血-脑脊液屏障作用于体温调节中枢的体温调定点,将体温调定点上移，使机体产热增加，末端血管收缩，汗毛孔关闭等，散热减少，体温上升引起发热[17，20]。

同时上皮细胞产生大量的细胞因子以及趋化因子等炎症因子，如炎症因子IL-6、IL-17、TNF-α、IL-29等，引发气管以及支气管痉挛等上皮细胞的病理改变，例如黏液分泌量增多、上皮细胞碎片的脱落及中性粒细胞聚集等，这些病理改变引起细支气管的阻塞，进而导致炎症及疾病的产生。

我国中草药资源丰富，中医药文化底蕴醇厚。中医讲究采用与疾病的证候性质相反的中药治，即治疗热性疾病，投以寒药；但凡内热之高热、恶热、烦渴、湿疮湿疹、湿温、夜热早凉等,俱可使用清热药。《神农本草经》曰“疗热以寒药”。《黄帝内经》中指出：“热者寒之”的意义，即“热者寒之”语出《素问·至真要大论》。证属于热的，用寒凉性药物治疗。热证有表热、里热、虚热、实热等不同，属于里的用“清法”。因此中医常用清热药主治里热证。

现代药理研究表明，清热药具有解热、抗炎、抗病原微生物作用、调节免疫功能及抗肿瘤等多种药理作用，具有很好的研究价值和应用前景。其抗病毒方面的活性尤其受人关注，这些药理活性主要与其含的酚类、苷类和黄酮类成分有关。

2.1 解热作用 据本草及民间草药记载，结合现代药效学，发现多种中草药具有很好的退热作用，如石膏、知母[21]、柴胡、黄连，其清热药的解热作用可能与抑制细胞反应因子有关。

邹珊珊等[18]研究连翘提取物不同给药途径对副流感病毒致热家兔发热模型的影响时发现，连翘酯苷静脉注射和口服灌胃均能降低家兔的体温,但静脉注射的解热作用优于口服灌胃。其解热作用可能是抑制家兔下丘脑组织中神经元cAMP释放，从而降低下丘脑cAMP含量,致使体温下降。周永学等[22]研究中药石膏解热抗炎作用，用合格大鼠按体重随机分为空白对照组、模型对照组、生石膏组、煅石膏组、CaSO4·2H2O组、阿司匹林组,每组分别连续灌胃7 d，用干酵母诱导大鼠发热，于2、3、4、5、6、7、8、9、10 h测大鼠肛温，结果发现生石膏能明显降低发热大鼠的温度，其机制可能与降低下丘脑PGE2含量有关。

2.2 抗炎作用 柳金英等[23]从中西医结合角度阐述中医“热毒”的主要表现是炎性反应,大量临床研究表明，许多清热药对炎症的各个环节均有一定的抑制作用，如金银花、连翘、黄连、栀子、穿心莲、蒲公英等[24]。

Lou等[25]研究金银花提取物绿原酸治疗类风湿性关节炎时发现，绿原酸可以抑制由 IL-6引发的成纤维细胞样滑膜细胞(FLSs)炎性增殖，主要与JAK- STAT，NF-κB2条信号通路相关，可以显著减少JAK/STAT 通路上p-STAT3与JAK1 的表达以及NF-κB 通路上p50 与IKK 的表达，抑制IKK的磷酸化。Jang等[21]用仙鹤草提取物改善高脂饮食大鼠糖耐量时发现，高脂饮食可引起肝脏组织的炎症反应，仙鹤草提取物可以降低血清TNF-α、IL-6水平，抑制炎症反应，改善糖代谢。

2.3 抗病原微生物作用 大多数清热药都有一定程度的抑菌、抗病毒作用，如黄柏、黄芩、黄连、连翘、防风、金银花、千里光等；但其抗病原微生物范围和强度各不相同。抗病原微生物作用的发挥途径主要是通过调动体内积极因素以减轻细菌、病毒对组织细胞的破坏作用和降低病原微生物毒理的方式。

陈仁德等[26]制备黄连、黄芩、连翘的中草药提取物，采用纸片琼脂扩散法测定抑菌圈大小，结果显示以上3种药物提取物均对金黄色葡萄球菌的敏感性较高，抑菌圈大于6 mm，因此说明对金黄色葡萄球菌的抑制度较强。

徐硕超[27]研究黄芩、黄连抑菌作用效果，以大肠杆菌、嗜酸乳杆菌为实验菌株，用比浊法来测定以上清热药对大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC)时发现，黄芩、黄连对大肠杆菌和嗜酸乳杆菌均有抑制作用。姚凝[28]用苦参提取物(氧化苦参碱)对慢性乙肝病人的外周血单个核细胞(PBMCs)进行刺激,发现氧化苦参碱可刺激 PBMCs 释放大量干扰素α(IFN-α)和干扰素γ(IFN-γ)，以发挥其抑制HBV作用。

2.4 对机体免疫功能的影响 清热药物能普遍地影响机体免疫功能的各个方面，可提高细胞的吞噬能力，促进抗体生成及细胞免疫,从而增强机体的免疫功能;又能抑制异常的免疫反应[24]， 如板蓝根、蒲公英、紫花地丁、半枝莲。刘小艺等[29]综述黄连素对肠道黏膜免疫功能有较好的调节作用。阐述黄连素可能是通过抑制Th1、Th17细胞的分解及促炎症因子IL-6、IL-23、IL-2等的分泌，提升Treg 细胞对机体免疫作用。李吉萍等[30]研究板蓝根多糖 (RIP) 抗肿瘤作用时发现不同剂量的板蓝根多糖均可明显抑制肿瘤的生长,同时还增强脾淋巴细胞及 NK细胞的杀伤活性,升高血清中TNF-α、INF-γ 和 IL-2的含量。由此推断出，RIP能增强荷瘤小鼠的免疫功能,能延长荷瘤小鼠的生存时间。

3 清热药抗 RSV 的机制研究

清热药主要通过直接和间接两种途径发挥抗 RSV 的作用,即祛邪兼扶正功能[31]。“祛邪”指药物直接作用于病毒，阻断病毒对受体细胞的吸附、穿入、复制、蛋白质合成等繁殖过程的某一环节，继而杀灭病毒，达到抗病毒作用;“扶正”则为间接抑制病毒，即药物通过调节机体的免疫功能或通过诱生干扰素(IFN)达到抗病毒的目的[32]。

3.1 直接抗病毒作用 黄筱钧[33]研究甘草抑制RSV机制，以利巴韦林为对照，用噻唑蓝(MTT)法测定，逐日记录细胞病变效应(CPE)。结果发现甘草抑制病毒DNA聚合酶的活性进而抑制RSV在细胞内的增殖；甘草的活性成分能破坏RSV表面的蛋白结构从而阻断RSV与细胞的吸附，RSV包膜等结构的活性成分被甘草破坏，导致RSV直接被灭活。

刘钊等[34]设置抗病毒口服液和病毒唑为对照组，观察病毒引起的CPE，用MTT法计算病毒抑制率发现，大青叶抑制RSV是发生在病毒入侵细胞后，干扰病毒基因组的复制或者阻止病毒蛋白合成，从而阻断 RSV的复制周期。

3.2 间接抗病毒作用(免疫调节作用) 通过作用TLR/IFN-γ，激活细胞对 RSV 的免疫反应，促进细胞因子的释放，增加免疫球蛋白的合成，发挥抗病毒效应[35]。张沛等[36]研究黄芩抗病毒作用，采用ELISA法检测大鼠体内Ⅰ型干扰素和炎性因子IL-6和IL-12的表达量的变化，结果显示黄芩苷可上调RSV感染大鼠体内Ⅰ-IFN的表达，并可能通过下调IL-6和IL-12的水平来抑制SOCS1/3的表达，发挥抗病毒作用。

侯宪邦等[37]研究板蓝根含药血清对呼吸道合胞病毒(RSV)感染RAW264.7细胞后对干扰素-β(IFN-β),Toll 样受体3(TLR3)、TBK1、干扰素调节因子3(IRF3)的表达，实验以不同浓度的利巴韦林含药血清为对照组，发现板蓝根含药血清下调TLR3信号通路关键信号分子 TLR3、TBK1、p-IRF3蛋白高表达有剂量依赖性，可以通过信号转导作用导致IRF3磷酸化增加，从而适度降低IFN-β的过量表达而发挥抗RSV的作用。

4 从清热药中筛选抗 RSV 药物的思路

RSV感染主要为下呼吸道感染，如肺炎或细支气管炎等，临床表现主要为发烧、咳嗽、喘息、呼吸困难等症状。RSV 感染致病机制：RSV 感染首先直接导致气道黏膜损伤，造成气道阻塞，间接性促进了气道炎症的发生。其次刺激机体释放大量细胞因子和趋化因子，激活机体的固有免疫应答、B 细胞介导的体液免疫应答及 T 细胞介导的细胞免疫应答，从而达到抗 RSV 的作用。因此我们可以从抑制炎症和增强机体免疫力两方面探寻新的具有抗 RSV 活性的药物[38]。

中医通过辨证论治，多成分、多靶点治疗不断变异的病毒感染性疾病，具有安全、高效、不良反应少、无耐药性等疗效优势,因此筛选高效低毒的抗病毒中药是当前抗病毒研究热点之一。临床实践证明清热药在抗呼吸道合胞病毒感染方面疗效显著，尤其是清热解毒类中药，除杀灭病原微生物外，还具有多种免疫学活性，能非特异性增强免疫系统功能,改善机体状况,调动机体免疫功能，增强对各种感染的抵抗力。临床中我们更注重病毒-机体-药物三者的关系，多途径、多环节达到整体综合调节作用。因此，我们应该把清热药作为筛选抑制RSV中药的首选对象。

4.1 Meta 分析 Meta 分析是系统综述中将以往同类研究的结果进行综合分析的一种方法。李跃文等[39]用网状Meta 分析补益类中药注射液辅助治疗病毒性心肌炎的作用效果，对纳入的文献分析得出：与单用常规治疗比较，生脉注射液、参麦注射液、黄芪注射液、参芪扶正注射液 4 种补益类中药注射液联合常规较好辅助治疗病毒性心肌炎，但是提高总有效率及改善心电图方面参麦注射液为首选项,而黄芪注射液能更好降低心肌酶 (CK-MB、AST) 水平。

我们可以通过网状Meta全面分析比较国内外清热药抗病毒的研究现状和热点。甚至用网状Meta技术评价中药联合常规西药治疗RSV感染性疾病的疗效，为进一步临床用药治疗病毒感染性疾病提供理论依据。通过网状Meta了解中药抗病毒作用的有效性和安全性，判断某类具体药物抑制病毒作用的效果和强度，药物通过哪种方式(直接灭活、阻止病毒吸附和抑制生物合成)发挥抗病毒作用，更为我们后期做清热药体外抗 RSV 药理学试验做好准备。

4.2 网络药理学 Hopkins[40]2007年首次提出了网络药理学的概念。在中药药理作用机制研究、药物重新定位、先导化合物的发现、新药靶的识别以及毒副作用研究等方面取得了较好成绩，具有系统预测、动态分析等特点的研究手段,与传统中医药整体观与辨证论治的原则是一致的。

苏真真等[32]利用网络药理学中的分子对接技术分析银黄口服液成分的化学空间分布及主成分，发现药物中含有治疗呼吸道感染疾病的活性化合物。药-靶网络图的虚拟筛选，分析出药物发挥炎症反应的潜在靶标，推测出了银黄口服液抗呼吸道感染的药效物质。衡霞等[41]利用网络药理学技术成功筛选出黄连解毒汤的有效成分，根据活性成分进行潜在靶点信息预测、通路分析及分子对接分析等，发现黄连解毒汤作用某靶点，影响相应产物的代谢，从而调节巨噬细胞炎症反应。

挖掘中药药效成分和预测其潜在功能靶标是网络药理学研究的两项基础工作,药物-靶点预测技术是网络药理学研究的核心技术之一。我们可通过“药物-靶点-疾病”网络模式,使用高通量技术快速有效地筛选清热药中抗RSV的活性成分,预测出清热药活性分子抗RSV的具体作用机制。为我们下一步的体外细胞实验验证工作减少工作量,降低新药开发成本。

5 展望

呼吸道合胞病毒(RSV)是全球、也是我国 5 岁以下儿童呼吸道感染的主要病原体,也是继肺炎链球菌和流感嗜血杆菌之后第三位致儿童肺炎死亡的病原体[42]。其主要病变在毛细支气管，亦可涉及支气管与肺泡，更是婴幼儿、老年人和免疫功能低下者诱发呼吸道感染的主要原因[43]。现在仍没有令人满意的安全性好针对性强的疫苗出现,供临床使用医治RSV的药品较少。目前国内外在中西医方面对抗RSV的研究日益增多，西医讲究对症治疗RSV感染，其药物主要为抗病毒药物、支气管扩张剂、抗炎药和免疫调节剂等。但这些药物对机体存在严重的毒副作用,而疫苗免疫率又较低。与化学药相比,中药可通过增强机体的免疫力,多方位抗击病毒感染，使病毒对其难以产生耐药性，其次中药治疗呼吸道感染时毒副作用较轻、治愈温和、资源丰富，价格低廉，这正是中药抗病毒所具有的独特优势。

清热药的研究历史悠久,药理作用广泛，大量的研究表明,清热药具有解热、抗炎、抗病原微生物作用、调节免疫功能及抗肿瘤等多种药理作用，因其具有较强的抗病毒活性逐渐受到重视。近年来，国内外对清热药抗病毒作用进行了筛选，在实验和临床研究中都有很大进展，但是清热药抗 RSV 的研究仍集中在单味中药抑制病毒增殖或调节机体的免疫应答方面,且作用机理尚不清晰;研究思路多效仿西药模式,缺乏中医药理论的指导；实验研究处于细胞水平，与临床用药相脱节。

因此，在清热药抗RSV的筛选中，我们应该除了从单味药着手外，也应对复方制剂、拆方、中药有效成分、多种有效成分联合应用等多个方面进行研究，为研发抗RSV的新剂型提供参考条件；其次调整抗病毒机理研究方向，如用含药血清为样品,模拟药物代谢的体内过程,使结果与临床用药特点更相近；可深入研究清热药抗RSV作用机制,为快速寻找安全有效、特异性针对RSV感染的高效能中药作出贡献。