用改良的酶比色法测定婴幼儿乳粉中胆碱的含量

□ 张 琳 贾 俊 吉林省产品质量监督检验院 曲玉超 吉林天圆检测有限责任公司付连娟 吉林省产品质量监督检验院 武旭明 冯 吉 长春工业大学化学与生命科学学院

胆碱（choline）是一种强有机碱性化合物，在动物有机体内的存在形式主要为游离态胆碱、乙酰胆碱、卵磷脂或鞘磷脂等。胆碱及其衍生物是对人体非常重要的一类具有生物功能的小分子代谢物，其重要意义在于能够促进神经元的信息传递，特别是对婴儿大脑的发育及代谢具有至关重要的作用。婴幼儿由于摄入的食物比较单一，容易造成胆碱类物质缺失，可能因此造成免疫力降低、记忆力损害及肾脏损害等疾病[1,2]。国家标准GB 14880-2012对婴幼儿配方奶粉中胆碱的添加限量作了明确规定，限量为 380 ～ 1 500 mg/kg[3]。

比较常见的胆碱检测方法有雷氏盐比色法[4]、高氯酸非水滴定法[5]、雷氏盐质量法[6]等，由于选择性不好，背景干扰因素比较多，可造成检测偏差较大。

现行国家标准GB/T 5413.20-2013[7]采用酶反应显色分光光度计法进行奸恶，这种检测胆碱含量的方法，优点是专属性较强，缺点是缺少对水解液的净化处理，其样品中的核黄素等发色物质，经水解后颜色加深，容易造成样品背景值增高；此外样品中含有的维生素C等还原性物质，会影响酶的氧化反应，容易造成胆碱测定值偏低，为克服以上检测过程中出现的问题，本文将提出一种改良的酶比色法，用于测定婴幼儿乳粉中胆碱的含量。

1 实验仪器与试剂

实验仪器：紫外可见分光光度计（T6新世纪）、电子天平（Metteler Toledo ML204）、数显恒温水浴锅（HH-6）、pH计（PHS-3C），离心机。

试剂：99%胆碱酒石酸氢盐标准品、过氧化氢酶、胆碱氧化酶、磷脂酶D,4-氨基安替比林、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、氢氧化钠与苯酚，活性炭粉，以上试剂皆为分析纯。

2 实验方法

2.1 实验原理

胆碱经酸水解后，加入活性炭对水解液进行净化，再经过酶氧化，然后发生显色反应，最后使用分光光度法进行测试。

2.2 样品处理

取5 g（精确到0.000 1 g）样品，1 mol/L的盐酸溶液30 mL，放在100 mL锥形瓶中，65～75 ℃水浴加热，不时震荡混匀，共需水解3 h，冷却至室温并用氢氧化钠溶液（500 g/L）调pH为3.5～4.0，加入0.5～2.0 g活性炭后涡旋振荡，离心过滤，将水解后的上清液转入50 mL容量瓶中。加入12倍配置好的酶反应液，同时应保证测试时滤液呈弱碱性，在37 ℃左右保温反应10～30 min，对样品溶液进行测定。

2.3 实验步骤分析

2.3.1 标准曲线

取2、4、6 mL与8 mL的胆碱标准溶液，按表1加入试剂，然后按照2.2中的方法进行处理。加入发色剂后，标准溶液发生颜色变化（见图1），混匀，将试管用密封膜密封，置于水浴中37 ℃保温反应15 min。

表1 标准曲线制备时的试剂添加量

图1 标准溶液梯度颜色图

2.3.2 活性炭含量对测试结果的影响

按表2中试剂的添加量要求，分别投放在准备好的8支试管中进行测试。通过以上的实验得出结论，加入0.6 g活性炭能使测定样品中还原型抗坏血酸完全氧化为脱氢型，其吸附影响不明显。由对比试管F、G、H可以看出，当不使用活性炭进行样品脱色处理时，测定结果准确度较差，回收率和重现性降低。

2.3.3 试样的测定

按表3所示的试剂添加量进行试验，每个试样都准备（B、C）2支试管。加入发色剂后标准溶液开始颜色反应，混匀后将试管用密封膜密封，置于水浴中37 ℃保温反应15 min。

3 实验结果

3.1 标准曲线方程

标准曲线方程为y=0.003 3x-0.018 2，相关系数R2=0.999 3，线性良好（见图2）。

3.2 实验结果

取4种不同婴幼儿配方奶粉5 g，用改进的方法进行检测，同一种样品取平行样，分别测胆碱含量，见表4。（检出限为1 mg/100 g，定量限为3 mg/100 g）

表2 测定加标样时的试剂添加量

表3 试剂添加量表格

图2 胆碱的标准曲线图

表4 胆碱含量

4 结论

通过添加活性炭等步骤，对检测方法进行改良，去除了维生素C等还原性物质对酶氧化反应的影响并减小背景值，该方法对婴幼儿乳粉中胆碱含量的测定更加准确、可行、高效。