楮实多糖对小鼠抗疲劳作用的研究

王丽敏，舒适，杨娟，*

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025；2.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州贵阳550014）

楮树（Broussonetia papyrifera），又名构树，为灌木类桑科构属植物，雌雄异株[1]。楮实子为构树的干燥成熟果实，资源丰富，具有悠久的药用历史，我国药典有收载。楮实子（Fructus Broussonetiae）始载于汉代《名医别录》，味甘性寒无毒，具有滋肾益阴、利水消肿的功效；周峰等研究显示楮实子含有丰富的氨基酸、脂肪酸、生物碱、多糖等化学成分[2]，庞素秋对中药楮实子的抗衰老活性成分进行了研究，阐述了楮实子补肾作用机理及其抗衰老的物质基础与分子机理[3]。楮桃即构树果实，其果汁中含有大量营养物质，其中可溶性糖和生理活性物质类黄酮的含量较高，且含有较多的维生素和可溶性蛋白质及多种矿质元素。有研究以楮实为主要原料，经过最佳的发酵工艺，研制出一款营养丰富、酸甜爽口、风味独特的果酒，这种果酒也是一种新型营养保健饮品[4]。周文美等以新鲜楮桃和番茄为主要原料，通过酒精发酵和醋酸发酵，制作出楮桃和番茄复合型果醋，并对其生产工艺和工艺参数进行了研究[5]。

目前对楮实的研究甚少，文献多为历代本草记载的有关中医学理论的综述性文章，关于楮实多糖的研究更是寥寥少数。因此本文充分利用传统中药资源楮实，从中提取得到楮实多糖，并进一步对其抗疲劳作用进行考察，将有利于传统中药楮实活性成分及营养保健机理的深入研究，对楮实资源的开发利用奠定前期基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

楮实鲜果，采自贵州省贵阳市药用植物园内，经贵阳中医学院孙庆文教授鉴定为桑科构属植物构树Broussonetia papyrifera（Linn.）Vent 聚花果。

昆明种小鼠，雌雄各半，6 周～8 周龄，体重（20±2）g，贵州医科大学实验动物中心提供。肌糖原及肝糖原测定试剂盒、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）测试盒、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）测试盒：南京建成生物工程研究所。

游泳箱（大小约 50 cm×50 cm×40 cm）[6]、BUCHIR220 旋转蒸发仪：Switzerland 公司；HP-8453 紫外可见分光光度仪：惠普公司；DZ-2BC 真空干燥箱：天津泰斯特仪器有限公司；TDL-40C 低速台式离心机、TGL-16B 高速台式离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 楮实粗多糖（crude polysaccharide from Broussonetia papyrifera，CS）制备

参考响应面分析法优化楮实多糖提取工艺[7]，楮实鲜果经60 ℃真空干燥后粉碎过80 目筛，用80%乙醇提取2 h，提取至提取液颜色变为淡黄色为止，抽滤得固体粉末，再经60 ℃真空干燥制得楮实粉备用。取楮实粉置于圆底烧瓶中，按料液比1 ∶10（g/mL）加入蒸馏水至提取罐中，沸水浴提取2 h。提取液室温（37 ℃左右）冷却过滤，合并滤液，浓缩冷却至室温（37 ℃左右），经 4 000 r/min 离心 15 min，重复提取 3 次后，提取液合并，上清液减压浓缩至一定体积后，加入95%乙醇进行醇沉，终浓度不低于80%。所得沉淀依次用无水乙醇、丙酮洗涤，真空干燥得粗多糖。参考苯酚-硫酸法对慈姑多糖含量的测定[8]，制作葡萄糖标准曲线以及测定样品中多糖的含量。

1.2.2 楮实多糖的抗疲劳活性研究

1.2.2.1 动物分组及给药剂量

取健康小鼠120 只，雌雄各半，按体质量随机分为空白对照组，楮实多糖低剂量组（CS-L）、中剂量组（CS-M）、高剂量组（CS-H）3 个剂量组。每组 30 只，自由摄食和饮水，给药剂量为：20、50、80 mg/（kg·d）；空白组给予等体积生理盐水。每天根据小鼠体重定时灌胃给药（按 0.1 mL/10 g），饲养温度（20±3）℃，湿度（55±6）%。

1.2.2.2 小鼠疲劳模型的建立

小鼠在（30±2）℃水中不负重游泳60 min 造成疲劳，游泳停止后90 min 和150 min，每组随机抽取10 只小鼠取肌肉、肝脏和血清样品测定肌糖原、肝糖原、乳酸脱氢酶和血尿素等指标[9-11]。

1.2.2.3 肌糖原和肝糖原含量的测定

小鼠经脱颈椎处死后立即取新鲜肝脏和肌肉样本用生理盐水漂洗后，滤纸吸干，称重（质量≤100 mg）。按照样本质量（mg）∶碱液体积（μL）=1 ∶3，一起加入试管中，沸水浴煮20 min，流水冷却，使样品水解。加蒸馏水配制成糖原检测液，肝糖原测定的蒸馏水添加量（mL）为肝重的96 倍，肌糖原测定的蒸馏水添加量（mL）为肌肉的16 倍。按照试剂盒的说明，进行肌糖原和肝糖原含量的测定。

1.2.2.4 乳酸脱氢酶活力的测定

小鼠断头取血，室温（37 ℃左右）下放置30 min后，4 000 r/min 离心10 min 得上层透明液为小鼠血清。按照试剂盒的说明，进行乳酸脱氢酶活力的测定。

1.2.2.5 尿素氮含量测定

样品操作同1.2.2.4。

1.3 数据分析

应用SPSS 17.0 软件进行统计分析，结果均以均数±标准偏差表示，并进行ANOVA 分析，多重比较采用 Dunnet’s 法，P＜0.05 为差异显著。

2 结果与分析

2.1 楮实多糖含量测定

以葡萄糖含量为横坐标，其相应的吸收值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，得回归方程为：y=6.348 5x+0.015 7，式中：x 为葡萄糖含量，mg；y 为吸光度），相关系数R2=0.997 9。取楮实多糖样品液，于波长490 nm处测定吸光度值，代入回归方程，计算其多糖含量为6.03 mg/g。

2.2 楮实多糖对糖原含量的影响

肝糖和肌糖是机体内贮存糖原的主要方式，在运动过程，肌肉对肌糖原的需求增加，肝糖原快速分解，释放葡萄糖快速入血，维持机体血糖以满足运动肌肉对糖的需求，且肌糖原和肝糖原对维持机体运动的耐力较重要[12]。小鼠运动前后肌糖原含量、肝糖原含量、肌糖原储备增长率及恢复率的变化见表1～表3。

表1 小鼠运动前后肌糖原含量的变化Table 1 Changes in muscle glycogen contents before and after exercise in mice

表2 小鼠运动前后肝糖原含量的变化Table 2 Changes of liver glycogen contents before and after exercise in mice

表3 运动前后小鼠肌糖原储备增长率及恢复率变化Table 3 Changes in muscle glycogen reserve growth and recovery rate in mice before and after exercise

由表1～3 可知，在肌糖原和肝糖原含量的变化中，静息时CS3 个剂量组20、50、80 mg/（kg·d）与对照组相比差异显著（P＜0.05）；运动后3 个剂量组的糖原含量仍显著高于对照组，其中50 mg/kg·d 剂量组的糖元储备增长率和恢复率要明显好于其他组。说明楮实多糖能增加糖原储备，为机体提供更多能源物质。

肌糖原、肝糖原和血糖是机体内的三大糖储备。当糖原耗竭，将会影响运动的持久力，因此肌糖原含量可作为反映疲劳程度的重要指标[13]。由表3 可知，楮实多糖低、中、高剂量均能够增加小鼠肝糖原和肌糖原的恢复率，其中肌糖元储备增长率分别为33.18%、39.49%、23.84%，且中剂量组效果比较好。

2.3 楮实多糖对乳酸脱氢酶活力的影响

乳酸脱氢酶是糖无氧酵解及糖异生的重要酶系之一，它能将机体剧烈运动产生并堆积在肌肉中的乳酸转化为丙酮酸，减少乳酸在肌肉中的堆积。不同给药剂量对LDH 活力的影响见表4。

表4 小鼠运动前后乳酸脱氢酶活力变化Table 4 Changes of lactate dehydrogenase activity before and after exercise in mice

游泳前各给药组的LDH 活力明显高于对照组，游泳后90 min 的LDH 活力高于游泳前，游泳后150 min相比游泳后90 min 的LDH 活力有所下降，但仍略高于对照组，存在显著差异（P＜0.05），其中以50 mg/（kg·d）剂量组为最佳。说明楮实多糖能提高乳酸脱氢酶活力，可以加速肌肉中过多乳酸的清除，达到减缓疲劳和加速疲劳恢复的作用[14]。

2.4 楮实多糖对小鼠血尿氮含量的影响

尿素氮是体内氨基酸分解代谢的最终产物之一，机体血清尿素氮含量随运动负荷的增加而增加。由表5 和表 6 所示。

表5 小鼠运动前后血尿素氮含量变化Table 5 Changes of blood urea nitrogen before and after exercise in mice

小鼠在静息时给药组体内尿素氮含量明显小于对照组，运动后血尿素含量升高，各给药组运动后血尿氮增加量均显著小于对照组。各给药组对血尿素的清除速率均显著大于对照组，其中以50 mg/kg·d 效果为最好，清除速率达到25.67%，清除速率值越大抗疲劳效果越好。当给药剂量增加至80 mg/kg·d 时，抗疲劳效果并无显著差异。从血尿氮的增量来看，各剂量组的增量都小于对照组，表明楮实多糖能够抑制或减少疲劳小鼠血清尿素氮的产生，提高小鼠的抗疲劳能力。

表6 各剂量对清除速率和小鼠运动后血尿氮增量的影响Table 6 Effects of different doses on clearance rate and blood urine nitrogen increment after exercise in mice

3 结论

疲劳是机体复杂的生理生化变化过程，引起身体与精神状态的下降，进而导致工作能力及工作效率的衰退，肝糖原、血清尿素氮及其乳酸含量通常作为检测疲劳的生化指标[15]。肝糖原的主要作用是维持血糖的相对稳定，随着运动时间的延长，血糖水平开始下降，肝糖原分解作用增加，一旦肝糖原分解耗竭，会使运动肌功能不足，导致外周疲劳[16-17]。本研究表明楮实抗疲劳作用可能与增加肝糖原的储备有关。当机体长时间运动，不能得到肝糖原分解代谢产生的足够能量时，机体蛋白质与氨基酸分解，产生大量尿素氮。机体尿素氮含量随运动负荷增加而增加，机体对负荷的适应能力越差，血清尿素氮的增加就越明显。在实验中3 个多糖剂量组对血尿素的清除速率均显著大于对照组，其中以50 mg（/kg·d）效果为最好，清除速率达到25.67%，且多糖剂量组的血尿氮增量低于对照组，说明楮实多糖能够抑制或减少疲劳小鼠血清尿素氮的产生，提高小鼠的抗疲劳能力。

楮实粗多糖的20、50、80 mg（/kg·d）剂量组均能显示出具有提高小鼠在运动前后体内肌糖原和肝糖原储备量、乳酸脱氢酶活力及降低血尿氮含量的功效，发现楮实多糖对小鼠有明显的抗疲劳作用，在本实验条件下，小鼠抗疲劳作用与多糖浓度表现出一定的量效关系，随着给药剂量增加，其作用增强，其中50 mg（/kg·d）剂量抗疲劳效果最好，继续增大给药量其抗疲劳结果无显著差异。