黑曲霉胞外酶对乌龙茶中茶多酚的影响研究

李文静，李红，倪辉，李利君

（集美大学食品与生物工程学院福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建厦门361021）

茶叶是我国重要的农产品[1-3]，乌龙茶是我国第3大类茶。乌龙茶因具有独特的风味及防癌、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗肥胖等[4-7]保健功效故深受消费者喜爱。

茶多酚物质是茶汤滋味中苦味、涩味的主要呈味成分，也是茶叶中最重要的活性组分。一般说来，儿茶素类物质是茶叶中最主要的茶多酚[2]，常见的8 种儿茶素是表儿茶素（epicatechin，EC）、表没食子酸儿茶素（epigallocatechin，EGC）、表没食子酸儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、表儿茶素没食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、儿茶素（catechin，C）、没食子酸儿茶素（gallocatechin，GC）、没食子酸儿茶素没食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）和儿茶素没食子酸酯（catechin gallate，CG）[8-9]。Zhao 等[3]在乌龙茶中同时检测到 6 种儿茶素：EGC、C、EGCG、EC、GCG 和ECG，其中 EGC、EGCG、EC 和 ECG 的含量较高。研究表明，这些儿茶素类物质具有多种生物活性，如中和活性自由基[10]，去除金属离子催化[11]，调节信号分子[12]，影响凋亡调控基因的表达[13]，减轻炎症[14]，诱导一氧化氮合成酶和环脱氢酶活性[15]，其中EGCG 被认为是儿茶素中活性最强的成分。

由于茶多酚物质是形成茶香气和滋味品质的重要物质基础之一，因此对茶的香气和滋味进行改良是茶叶加工领域的热点课题。研究表明纤维素酶类、糖苷酶类等外源酶对茶叶中茶多酚成分具有显著影响，对于改善茶的品质具有重要意义。黑曲霉（Aspergillus niger）是常用的食品酶制剂生产菌株，安全性高，能够分泌多种胞外蛋白酶组分。Kim 等[16]利用商品化的黑曲霉来源的纤维素酶处理绿茶渣，结果表明纤维素酶处理可以显著提高浸提液中总茶多酚、总儿茶素和还原糖含量。Baik 等[17]采用商品化的黑曲霉来源的单宁酶和果胶酶处理绿茶叶，发现提取物中的非酯型儿茶素含量显著上升，酯型儿茶素如EGCG 含量显著降低，并且抗氧化活性增强；而果胶酶则通过水解绿茶多糖，使得提取物中活性多糖的含量显著提高。

茶多酚的检测方法有高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC），毛细管电泳法（capillary electrophoresis，CE）[18-19]，氢谱的核磁共振法（1H-nuclear magnetic resonance，1H-NMR）[20]，近红外光谱法（near infrared spectroscopy，NIRS）[21]，气相色谱质谱联用法（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）[22]和液相色谱质谱联用法（liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS）等。目前应用最广泛的方法仍是高效液相色谱法，但近年来使用LC-MS[23]或者HPLC-MS/MS[24]测定儿茶素也成为研究热点，可以实现快速准确的定量测定儿茶素含量。

前期研究发现从乌龙茶测定的9 种儿茶素中含有多组差向异构体，如 C 和 EC、EGCG 和 GCG、ECG 和CG、GC 和ECG，这些表型和相应非表型儿茶素通过质谱图很难区分，因此本研究首先对建立的LC-MS/MS方法进行了优化，通过液相色谱实现了差向异构体的分离，并使用优化后的方法对乌龙茶中儿茶素的含量变化进行分析。随后，利用优化后的检测方法，分析了6 种不同培养基发酵黑曲霉产生的胞外酶液处理乌龙茶后对其茶多酚组分变化影响，为直接利用微生物发酵制备的胞外酶改善茶叶品质提供了参考依据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

黑曲霉菌株：购自中国工业微生物菌株保藏管理中心（CICC）；乌龙茶：市售；没食子酸（GA）、没食子酸儿茶素（GC）、表没食子酸儿茶素（EGC）、儿茶素（C）、表儿茶素（EC）、表没食子酸儿茶素没食子酸酯（EGCG）、没食子酸儿茶素没食子酸酯（GCG）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）和儿茶素没食子酸Z 酯（CG）的纯度≥98%（HPLC-DAD 检测）：成都普瑞法科技开发有限公司；乙腈（色谱纯）、甲酸（色谱纯）：Sigmaaldrich。福林酚试剂、甲醇、碳酸钠为国产分析纯：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黑曲霉发酵胞外酶粗酶液的制备

分别用马铃薯葡萄糖琼脂培养基、马铃薯葡糖液体培养基（potato dextrose agar，PDA）、察氏液体培养基（察氏）、果胶液体培养基（果胶）、麦麸固体培养基（麦麸）、柚皮粉固体培养基（柚皮）以及茶叶梗固体培养基（茶叶梗）发酵黑曲霉。液体培养基取其发酵液；固体培养基，待发酵完成后，麦麸和柚皮粉固体培养基加入pH 7.0 的磷酸盐缓冲液，茶叶梗固体培养基加入pH 7.0 的磷酸盐缓冲液，20 ℃下180 r/min 振荡浸提1 h。浸提后抽滤得粗酶液。

1.2.2 儿茶素标准储备液的配置

分别称取 GA、CG、EGCG、EGC、EC、GCG、C、GC 和ECG 标准品，用50%乙腈水溶液溶解，配制成1 mg/mL的储备液。

1.2.3 样品溶液的配置

1.2.3.1 乌龙茶样品溶液配制

称取1.000 g 粉碎的乌龙茶，加入40 mL 预热的蒸馏水，振荡摇匀。40 ℃水浴浸提，浸提后沸水浴5 min，再过滤，洗涤，定容至50 mL。

1.2.3.2 黑曲霉胞外酶浸提乌龙茶样品溶液配制

称取1.000 g 粉碎的乌龙茶，加入15 mL 预热的黑曲霉胞外酶液和25 mL 预热的蒸馏水，振荡摇匀后如1.2.3.1 的方法制备。对照组如1.2.3.1 方法所示。

1.2.4 色谱条件的优化

初始的色谱条件：流动相A（含有0.1%甲酸的超纯水溶液）、B（含有0.1%甲酸的乙腈溶液），进样量为5.0 μL，色谱流速 0.5 mL/min，柱温设为 25 ℃。洗脱梯度如表1。

表1 梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution condition

1.2.4.1 色谱柱的选择

按照初始色谱条件，分别使用3 种色谱柱：Spursil C1（8150 × 2.1 mm，3 μm，Agilent）、Zorbax SB-C1（8150 ×4.6 mm，5 μm，Agilent）和 Nucleodur PFP（250 × 4.6 mm，5 μm，Macherey-nagel），比较不同色谱柱的分离度和分析时间，选择分离度高而分析时间短的柱子进行下一步优化。

1.2.4.2 梯度洗脱的优化

色谱条件同1.2.4，使用1.2.4.1 优化得到的色谱柱，按照表2 梯度方法优化洗脱梯度，比较不同梯度方法的分析时间，选出优化的洗脱梯度。

1.2.4.3 柱温条件的优化

在 1.2.4.2 方法的基础上，考察温度为 25、30、35 ℃和40 ℃时色谱柱的柱温对色谱分离度和灵敏度（信噪比）的影响，选择柱温条件。

表2 梯度洗脱方法Table 2 Three kinds of gradient elution methods

1.2.5 方法学考察

1.2.5.1 线性关系测定

取一定量的各个标准品的储备液用乙腈水溶液稀释成一系列浓度梯度的混合标准。茶叶中各种儿茶素的含量差别较大，因此使用不同的浓度范围，即GA、GC、ECG 和 CG 的浓度范围为 40 μg/L～2 000 μg/L，C 和 EC 的浓度范围为 20 μg/L ～2 000 μg/L，EGC、EGCG 和 GCG 的浓度范围为 20 μg/L～5 000 μg/L。根据1.2.3 优化的色谱方法，在质谱MRM 模式下进行分析，得到标准曲线方程。

1.2.5.2 方法精密度和准确度试验

通过日内和日间变化来评价定量方法的精密度和准确度。日内变化是在同一天测定同一个一定浓度的混合标准品溶液6 次，计算含量和误差。日间变化是连续3 d 测定同一个混合标准品溶液，每日一次，计算含量和误差。按照公式（1），测定含量和理论含量的比值反应准确度，标准偏差反应精密度。

1.2.5.3 回收率试验

回收率使用标准加入法测定，选择一个儿茶素含量较低的已知浓度的茶汤样品，向样品中添加一定量标准品，然后把加标后的样品按照与样品相同的处理方法处理后上机测定，回收率的计算见公式（2）。

1.2.6 定性定量分析乌龙茶汤中儿茶素

通过对比标准品的保留时间和质谱信息对样品中儿茶素进行定性。样品中儿茶素的含量通过外标法测定。

1.2.7 黑曲霉胞外酶浸提乌龙茶汤的总茶多酚含量测定

总茶多酚含量的测定参考GBT8313-2008《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》，以各个没食子酸工作液的吸光度值为y 轴，其相应的浓度为x 轴，制作标准曲线。

1.2.8 LC-MS/MS 测定黑曲霉胞外酶浸提乌龙茶汤中儿茶素含量

样品溶液测定前用0.22 μm 的有机系微孔滤膜过滤，然后稀释100 倍进行LC-MS 分析，LC-MS 的采集方法使用优化后的条件，儿茶素的定性和定量分析方法同1.2.6。

1.2.9 感官评价黑曲霉胞外酶浸提乌龙茶汤的滋味

按照1.2.1 的方法将制得的黑曲霉胞外酶液进行纯化。称取1.000 g 粉碎的乌龙茶，加入1 mL 预热的纯酶液和14 mL 预热的蒸馏水，振荡摇匀。对照组直接加入15 mL 预热的蒸馏水，振荡摇匀。40 ℃水浴浸提60 min，浸提后过滤，定容至50 mL，待评价。

黑曲霉胞外酶浸提乌龙茶汤的滋味感官评价参考文献中方法[25]，滋味评价指标分别是：鲜味、苦味、涩味、甜味和酸味，各项指标使用10 分制（9 分= 极强烈，5 分 = 中等强度，0 分 = 极淡）。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

在初始色谱条件下，分别对不同的色谱柱进行选择，并对洗脱梯度方法以及柱温条件进行优化。最优条件下分离儿茶素标准品混合溶液的总离子流图（total ion chromatogram，TIC）如图1 所示，优化后的色谱条件为：选用 Nucleodur PFP 色谱柱，进样量 5.0 μL，流速0.5 mL/min，柱温35 ℃，梯度洗脱时间25 min。

图1 标准品的TIC 图Fig.1 The TIC of standard catechins

2.2 方法学考察结果

2.2.1 定量线性范围及检出限

利用一系列浓度的9 种标准品制作标准曲线，所得线性方程、相关系数、线性范围、检出限和定量限如表3 所示。

由表3 可知，9 条标准曲线的相关性均≥0.998，线性关系良好。EGC、CG、EGCG 和 GCG 的检出限和定量限最低，分别是 1 μg/L 和 4 μg/L。GA、GC、EGC、C 和EC的检出限是 4 μg/L，其中GC、C 和 EC 的定量限是 5μg/L，而 GA 和 EGC 的定量限分别为 10 μg/L 和 25 μg/L。EGC 的检出限和定量限最高，Zhao 等[3]和 Hu 等[26]的研究中也发现EGC 比其它儿茶素的定量限高，这可能与EGC 的化学结构有关。

表3 标准品的标准曲线方程、线性范围、检出限和定量限Table 3 Linear equation，linear range，correlation coefficient（r），limit of detection and limit of quantification of standard compounds

2.2.2 方法精密度和准确度

精密度和准确度测定结果见表4，对比日内和日间的精密度和准确度，日内的精密度和准确度一般比日间的好。9 种化合物日内的精密度≤3.72%，日间的精密度≤5.72%，日内的准确度在99.70%～104.16%之间，日间的准确度范围96.17%～106.61%，说明方法的精密度和准确度好，可以满足试验要求。

2.2.3 回收率

乌龙茶汤中 GA、GC、EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG 和CG 的加标回收率见表5。

表4 标准品的精密度和准确度Table 4 Precision and accuracy of standard catechins

表5 加标回收率Table 5 Recovery of standard catechins

由表 5 可知，GA、GC、EGC、C、EC、EGCG 和 ECG的回收率良好，范围是88.34%～107.52%。GCG 和CG的回收率较低，分别为76.05%和8.23%，造成CG 的回收率极低的原因尚不明确。所有标准品加标回收率的相对标准偏差≤3.59%。

2.3 乌龙茶汤中儿茶素含量测定

乌龙茶汤MRM 模式下TIC 图见图2。如图2 所示，通过和标准品的保留时间对比，并结合质谱信息，可以确定乌龙茶汤中含有9 种儿茶素：GA、GC、EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG 和 CG。

对乌龙茶汤中儿茶素含量见表6。

表6 乌龙茶汤中儿茶素含量测定Table 6 The contents of catechins in oolong tea infusion

由表6 可知，乌龙茶汤中占儿茶素总量最多的是EGC 和EGCG，百分比均在30%以上；其次是EC、GC、ECG 和 C，百分比均在 1%以上；而 GA、CGG 和 CG 的含量最低，百分比不足0.5%。

2.4 黑曲霉胞外酶液浸提乌龙茶汤的茶多酚的含量测定

图3 没食子酸标准工作曲线Fig.3 The standard curve of GA

2.4.1 黑曲霉胞外酶浸提乌龙茶汤的茶多酚总量测定

没食子酸标准工作曲线见图3，没食子酸标准工作曲线方程为：Y=0.011 6X+0.030 4，相关系数R2=0.999 6，线性相关性良好，说明所建立的没食子酸标准工作曲线可以满足试验要求。

胞外酶浸提乌龙茶汤中的茶多酚总量测定结果（已扣除酶液背景干扰）见图4。

图4 黑曲霉胞外酶处理乌龙茶汤的茶多酚总量Fig.4 The content of tea polyphenols in the oolong tea infusions extracted by extracellular enzymes

由图4 可知，乌龙茶提取液中茶多酚总量为1 712 mg/L，PDA 和察氏培养基所得酶液浸提乌龙茶汤中茶多酚总量无显著变化，柚皮和茶叶梗培养基所得酶液浸提的乌龙茶汤中茶多酚总量显著提高，增加量分别为9%和23%。Chandini 等[27]使用单宁酶液温育红茶叶，然后加水浸提红茶，结果发现红茶汤的茶多酚总量提高了14.3%。

茶叶中茶多酚包括儿茶素类、类黄酮类和黄烷醇类，它是重要的抗氧化剂，而且是茶叶中最主要的医疗活性成分[28]。因此茶多酚含量的增加，有利于增加茶叶的医疗价值。

2.4.2 LC-MS/MS 测定黑曲霉胞外酶浸提乌龙茶汤中儿茶素含量

不同来源的黑曲霉胞外酶浸提乌龙茶汤后对儿茶素含量的影响变化见表7。

表7 黑曲霉胞外酶浸提乌龙茶汤中儿茶素含量Table 7 The contents of catechins in the oolong tea infusions extracted by extracellular enzymes mg/L

由表7 可知，用果胶、麦麸和茶叶梗培养基发酵所得黑曲霉胞外酶液浸提乌龙茶汤的总儿茶素含量分别是 1 654.12、1 839.14、1 611.12 mg/L，明显高于未处理过的乌龙茶汤（1 537.53 mg/L）。另一方面，使用PDA、察氏和柚皮培养基发酵所得黑曲霉胞外酶液浸提乌龙茶汤中总儿茶素含量均有所下降，分别是565.44、1 278.57、1 428.70 mg/L。9 种儿茶素的含量测定结果表明（已扣除酶液背景干扰，表7），不同培养基发酵黑曲霉所得胞外酶液对乌龙茶汤中儿茶素的含量和组成产生了显著的影响（p＜0.05）。PDA 培养基发酵所得黑曲霉胞外酶液使乌龙茶汤中GA 的含量显著提高，对ECG 的含量无显著影响，但使C 等7 种儿茶素的含量均明显下降。察氏和柚皮培养基发酵所得黑曲霉胞外酶液对乌龙茶中儿茶素的溶出没有促进作用，9 种儿茶素的含量都没有增加。果胶培养基发酵所得黑曲霉胞外酶液显著增加了乌龙茶汤中EC、ECG和 EGCG 的含量，对 EGC、C、GA 和 GC 的含量无显著性影响，但是GCG 和CG 的含量显著下降。麦麸培养基发酵所得黑曲霉胞外酶液对提高乌龙茶汤中儿茶素含量有明显的促进作用，9 种儿茶素含量都显著高于未处理茶汤。用茶叶梗培养基发酵所得黑曲霉胞外酶液浸提乌龙茶汤中EC、EGC 和GA 的含量显著增加，而 C、CG、ECG、EGCG、GC 和 GCG 的含量显著下降。

为了进一步的分析不同培养基发酵所得黑曲霉胞外酶液对乌龙茶汤中儿茶素含量的影响，将9 种儿茶素分成3 类，分别是酯型儿茶素类（包括CG、ECG、EGCG、GCG），非酯型儿茶素类（C、EC、EGC、GC）和GA。

图5 黑曲霉胞外酶浸提乌龙茶汤中酯型和非酯型儿茶素含量变化Fig.5 The contents of galloylated catechins and non-galloylated catechins in the oolong tea infusions extracted by extracellular enzymes

由图5 可知，麦麸和果胶培养基所得黑曲霉胞外酶液浸提乌龙茶汤中酯型和非酯型儿茶素的含量都明显提高，而PDA、察氏和柚皮培养基所得黑曲霉胞外酶液浸提乌龙茶汤中酯型儿茶素类和非酯型儿茶素类的含量都有所下降。茶叶梗培养基所得黑曲霉胞外酶液浸提乌龙茶汤中酯型儿茶素含量急剧下降，同时非酯型儿茶素的含量大幅上升。以上结果说明6 种黑曲霉胞外酶液对乌龙茶汤的儿茶素种类和含量都产生了显著影响。

2.5 感官评价黑曲霉胞外酶浸提乌龙茶汤的滋味

7 名评茶员按照苦味、涩味、甜味、鲜味和酸味指标分别对6 种黑曲霉胞外酶液浸提的乌龙茶汤的滋味进行评价。黑曲霉胞外酶液浸提乌龙茶汤的滋味感官评价见表8。

表8 黑曲霉胞外酶液浸提乌龙茶汤的滋味感官评价表Table 8 Sensory evaluation results of the oolong tea infusions extracted by extracellular enzymes

乌龙茶汤中5 种滋味指标的强度顺序为：苦味＞涩味＞鲜味＞酸味＞甜味，可见铁观音乌龙茶的苦涩味比较明显。

研究表明非酯型儿茶素阈值比酯型儿茶素高，如EGC 的阈值比 EGCG 高约 2.5 倍[29-30]，所以当茶汤中酯型儿茶素含量降低时可以明显减轻茶汤的苦味和涩味。

表8 中感官评价表明，茶叶梗培养基所得酶液使乌龙的苦味和涩味都明显降低，这与LC-MS/MS 测定的茶叶梗培养基所得黑曲霉胞外酶液浸提乌龙茶汤中酯型和非酯型儿茶素含量变化结果一致；用麦麸培养基所得黑曲霉胞外酶液浸提乌龙茶汤的涩味显著增强，这与茶汤中酯型儿茶素的含量增加有关。图5表明PDA 培养基所得酶液浸提乌龙茶汤中酯型和非酯型儿茶素含量都明显降低，因而感官结果显示PDA培养基所得酶液使乌龙茶汤的苦味显著降低。综上可知，感官评价结果中苦味和涩味的强度变化与乌龙茶汤中酯型儿茶素的含量变化基本一致。此外，茶叶梗培养基所得黑曲霉胞外酶液处理使得乌龙茶汤的酸味明显增强，察氏、果胶和柚皮培养基所得黑曲霉胞外酶液处理对乌龙茶汤的滋味没有显著影响。鲜味和甜味的方差分析结果表明6 种培养基所得黑曲霉胞外酶液对乌龙茶汤的鲜味和甜味没有明显的改变作用。

3 结论

本文通过优化后的LC-MS/MS 方法测定乌龙茶汤中茶多酚组分变化，并对乌龙茶汤进行感官评价，研究了6 种培养基发酵黑曲霉所得胞外酶液对乌龙茶汤中茶多酚的影响。优化后的LC-MS/MS 方法相比UHPLC-UV[31]以及NIRS[32]等方法更为简单且分离度高，分离时间更短。黑曲霉是酶制剂生产菌株，根据不同的诱导基质能够分泌不同的胞外蛋白酶组分。用6 种不同的基质诱导黑曲霉发酵，对茶多酚的组分变化产生了不同的影响。结果表明，茶叶梗培养基所得酶液浸提的乌龙茶汤中茶多酚总量显著提高，同时乌龙茶汤中非酯型儿茶素的含量也大幅提高，而酯型儿茶素含量有所降低。果胶、麦麸培养基所得酶液浸提乌龙茶汤的总儿茶素明显高于参考乌龙茶汤，乌龙茶汤中酯型和非酯型儿茶素的含量也有所提高。PDA、察氏、柚皮培养基所得酶液浸提的乌龙茶汤中不仅总儿茶素含量降低，并且酯型儿茶素类和非酯型儿茶素类的含量也降低。

不同培养基发酵引起茶多酚的组分变化，进而影响其风味。感官评价结果表明，6 种黑曲霉胞外酶液对乌龙茶汤的鲜味和甜味无显著性影响。PDA 和茶叶梗培养基所得酶液使乌龙茶汤的苦涩味明显降低，麦麸培养基所得酶液浸提的乌龙茶汤中涩味显著增强，这与乌龙茶汤中酯型儿茶素的含量变化有关。