新疆黑蜂蜂王浆球蛋白酶解产物的抗氧化活性

姜建辉，周新，崔天伊，陈龙

（1.新疆生产建设兵团南疆化工资源利用工程实验室，新疆阿拉尔843300；2.塔里木大学生命科学学院，新疆阿拉尔843300；3.北京化工大学生命科学与技术学院，北京100029）

新疆黑蜂属于高加索蜂种，在我国主要分布于新疆伊犁昭苏县、新源县、尼勒克县等地。黑蜂是一种具有较强的繁殖能力，抗病抗逆力强，产蜜、蜡、胶量高，在-30 ℃以下也能安全越冬的优良蜂种。蜂王浆别名蜂乳、蜂皇浆、王浆，是工蜂舌腺和上颚腺等腺体的分泌物，有特殊刺激性气味，专用于喂养蜂王成虫和幼虫的淡黄色或乳白色浆状物质。蜂王浆主要营养成分为蛋白质、矿物质、有机酸、维生素和酶，蜂王浆具有调节免疫功能[1-3]，延缓衰老[4-6]，抗菌抗炎[7-9]，防癌抗癌[10-12]，调节血压[13-14]，降低血脂和血糖[15-16]等作用，其中抗氧化能力较为突出。研究发现蜂王浆水溶性蛋白酶解产物的抗氧化活性高于未水解蜂王浆水溶性蛋白的抗氧化活性，并且胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解产物的抗氧化活性是最强的[17-21]。本文根据经典的Osboren 分类，从新疆黑蜂蜂王浆中提取出球蛋白冻干粉，并且用胰蛋白酶在不同的反应条件下分别进行酶解试验，分别测定各条件下对DPPH·清除率、对亚油酸氧化的抑制能力和总抗氧化活性，从而寻找出不同体外抗氧化模型中新疆黑峰蜂王浆蛋白酶解物的最佳酶解条件。该结论可为新疆黑峰蜂王浆制品的高值化开发利用可以提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

FA1004B 电子天平：郑州宝晶电子科技有限公司；TD5Z 高速冷冻离心机：上海赵迪生物科有限公司；HJ8 集热式恒温磁力搅拌器：广州沪瑞明仪器有限公司；FD-1A-50 真空冷冻干燥机：杭州聚同电子有限公司；HH.S21-4 数显式恒温水浴锅：邢台润联机械设备有限公司；D-9143B-1 电热恒温鼓风干燥箱：杭州汇尔仪器设备有限公司；TGL-16G 高速台式离心机：北京市平建实验室设备有限公司；KQ-100B 超声波清洗器：上海市超声仪器有限公司；UV2400 分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；pHS-3C 精密pH 调节计：上海虹益仪器仪表厂有限公司。

新疆黑蜂蜂王浆：伊犁红郡蜂业有限责任公司；石油醚（AR）、氯化钠（AR）、无水乙醇（AR）、氢氧化钠（AR）、无水氯化亚铁（AR）：天津市致远化学试剂有限公司；盐酸：上海试剂一厂；亚油酸、磷酸缓冲液、总抗氧化试剂：北京索莱宝科技有限公司；2-苯基-苦阱基自由基（DPPH）：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；牛血清蛋白、考马斯亮蓝G-250：Sigma 公司；胰蛋白酶（BAEE＞9 000 U/mg）：Inventrogen 公司；硫氰酸铵（AR）：山东西亚股份有限公司。

1.2 蜂王浆球蛋白的混合物制备

结合经典的Osboren 分类，将新疆黑蜂蜂王浆粗蛋白分为水溶性蛋白、球蛋白、醇溶性蛋白、谷蛋白。首先称取318.43 g 蜂王浆于若干离心管中，调温至-80 ℃冷冻10 h，冷冻干燥，得106.23 g 冻干粉。再将冻干粉用石油醚按 1 ∶10（g/mL）的比例浸提 3 次，得脱脂蜂王浆冻干粉98.68 g。取脱脂冻干粉用超纯水按1 ∶10（g/mL）的比例在4 ℃浸提3 次，每次2 h，将总滤液用14 k 透析袋在超纯水中透析12 h。取不溶物用2%的NaCl 按1 ∶10（g/mL）的比例在 4 ℃重复浸提 3 次，滤液用 3.5 k透析袋在超纯水中透析12h，冷冻干燥得球蛋白4.09 g，用紫外吸收法估测蛋白纯度＞80%[22-23]。

1.3 球蛋白酶解条件的优化

1.3.1 溶液的配制

称取3.00 g 球蛋白定容于150 mL 的容量瓶得到浓度为0.02 g/mL 蜂王浆球蛋白溶液；称取200 mg 胰蛋白酶定容于100 mL 的容量瓶得到浓度为2 mg/mL 胰蛋白酶溶液，获得球蛋白酶解产物（globulin enzymatic hydrolysis product，GEHP）。

1.3.2 pH 值对DPPH·的清除率的影响

取5 个试管分别加入20 mL 0.02 g/mL 的蜂王浆球蛋白溶液，用浓度0.05 mol/L 氢氧化钠溶液调节各试管 pH 值分别为 6、6.5、7、7.5、8，按酶底比为 1%加入胰蛋白酶。在37 ℃恒温水浴锅中均反应3 h，各试管均在沸水浴中灭活15 min，冷冻干燥。

1.3.3 时间对DPPH·的清除率的影响

取5 个试管分别加入20 mL 0.02 g/mL 的蜂王浆球蛋白溶液，用浓度0.05 mol/L 氢氧化钠溶液调节各试管的pH 值均为7，按酶底比为1%（质量分数）加入胰蛋白酶。在37 ℃恒温水浴锅中各试管的反应时间分别为 1、2、3、4、5 h，各试管均在沸水浴中灭活 15 min，冷冻干燥。

1.3.4 温度对DPPH·的清除率的影响

取5 个试管分别加入20 mL 0.02 g/mL 的蜂王浆球蛋白溶液，用浓度0.05 mol/L 氢氧化钠溶液调节各试管的pH 值为7，按酶底比为1%（质量分数）加入胰蛋白酶。在温度为 27 、37、47、57、67 ℃ 的 5 个恒温水浴锅中均反应4 h，各试管均在沸水浴中灭活15 min，冷冻干燥。

1.3.5 酶底比对DPPH·的清除率的影响

取5 个试管分别加入20 mL 0.02 g/mL 的蜂王浆球蛋白溶液，用浓度0.05 mol/L 氢氧化钠溶液调节各试管的pH 值为7，各试管按酶底比（质量分数）为0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%加入胰蛋白酶。在47 ℃恒温水浴锅中均反应4 h，各试管均在沸水浴中灭活15 min，冷冻干燥。

1.4 抗氧化活性测定

1.4.1 DPPH·清除试验

将DPPH 溶于无水乙醇中，浓度为0.1 mmol/L。再取2 mL 0.1 mg/mL 不同酶解条件下的样品，样品中加入2 mL 0.1 mmol/L 的DPPH·无水乙醇溶液，混匀后在25 ℃下避光反应30 min，在517 nm 下测定吸光值为Ai；空白管用2 mL 无水乙醇溶液代替DPPH·无水乙醇溶液加入2 mL 相同浓度的待测样品，在517 nm 下测定吸光值为Aj；对照管用2 mL DPPH·无水乙醇溶液加入2 mL 去离子水代替样品，在517 nm 下测定吸光值为A0；以等体积去离子水和无水乙醇混合液空白调零。清除率按以下公式计算：

1.4.2 抑制亚油酸氧化法

取待测样品和对照物各1 mL，分别加入1 mL 浓度为2.51%的亚油酸无水乙醇溶液，加入2 mL 0.05 mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH 7.0）和1 mL 无水乙醇（针对待测样品）或去离子水（针对对照物），密闭后放在暗处并保持37 ℃恒温。取5 mL 上述混合液，加入5 mL 75%的乙醇溶液和5 mL 30%的NH4SCN，再加入5 mL 0.02 mol/L 已溶解于3.5%盐酸的FeCl2溶液，精准反应3 min 之后测定其在500 nm 处的吸光度，每隔24 h测定一次，共测7 d[24]。

1.4.3 总抗氧化能力测定方法

总抗氧化能力的测定反应原理是酸性条件下抗氧化物可以还原Fe3+-三吡啶三吖嗪（Fe3+-TPTZ）产生蓝色的Fe2+-TPTZ，随后593 nm 测定蓝色的Fe2+-TPTZ即可获得样品中的总抗氧化能力[24-25]。

配制0.1 mg/mL 新疆黑蜂王浆球蛋白酶解产物各组分试样，按照T-AOC 试剂盒说明进行试验，试验重复3 次，取平均值。总抗氧化能力用试验中样品管与对照管在593 nm 处的吸光度的差值大小进行比较。测定的吸光度的差值越大，总抗氧化能力越强。

2 结果与分析

2.1 球蛋白提取分离结果与分析

蜂王浆中蛋白质成分见表1。

表1 蜂王浆中蛋白质成分Table 1 The protein composition of royal jelly

试验所得冻干粉为106.23 g，其中球蛋白的干粉质量为4.09 g，脂类物质占干粉的7.11%。测得蜂王浆中含水量为66.63%，理论数值为64.5%～69.5%[16]。

2.2 抗氧化能力测定结果与分析

2.2.1 DPPH·的清除能力

2.2.1.1 pH 值对DPPH·的清除率的影响

按酶底比为1 %（质量分数）加入胰蛋白酶，在37 ℃恒温水浴锅中反应3 h，研究不同pH 值对蜂王浆酶解产物清除DPPH·效果的影响，结果见图1。

图1 不同pH 值对DPPH·清除能力Fig.1 DPPH·scavenging ability at different pH conditions

由图1 可知，随着pH 值的增加，黑峰蜂王浆球蛋白水解产物清除DPPH·的能力先升高后降低。当pH值由6 增大到7.5 时，清除率逐渐升高，随着pH 值的增大，球蛋白水解产物的清除率随之迅速下降，表明最佳pH 值为7.5。

2.2.1.2 时间对DPPH·的清除率的影响

按酶底比为1%（质量分数）加入胰蛋白酶，调节pH 值为7.5，在37 ℃恒温水浴锅中反应，研究不同水解时间对蜂王浆酶解产物清除DPPH·效果的影响，结果见图2。

同样，也可以进行定性的分析补充．利用将任务点打包发布的方法[9]，对附件提供的定价方案进行修改，可以将任务分布密度较大的地方价格调低，将偏远地区和未完成的任务价格调高．可以将热门任务和冷门任务打包在一起，让会员一起去执行，能够有效避免大量任务无人做的情况发生．

图2 不同反应时间对DPPH·清除能力Fig.2 DPPH·scavenging ability at different reaction times

由图2 可知，随着水解时间的增加，黑峰蜂王浆球蛋白水解产物清除DPPH·的能力缓慢升高，当水解时间为4 h 后清除率基本不变，故选4 h 为最佳水解时间。

2.2.1.3 温度对DPPH·的清除率的影响

按酶底比为1%（质量分数）加入胰蛋白酶，调节pH 值为7.5，反应4 h，研究不同水解温度对蜂王浆酶解产物清除DPPH·效果的影响，结果见图3。

由图3 可知，随着水解温度的增加，黑峰蜂王浆球蛋白水解产物清除DPPH·的能力逐渐升高，当水解温度为57 ℃时清除率最高，随后清除率随之下降，故选57 ℃为最佳水解温度。

图3 不同温度对DPPH·清除能力Fig.3 DPPH·scavenging ability at different temperatures

图4 不同E/S 对DPPH·清除能力Fig.4 DPPH·scavenging ability at different E/S

2.2.1.4 酶底比对DPPH·的清除率的影响

调节pH 值为7.5，在57 ℃恒温水浴锅中反应4 h，研究不同酶底比对蜂王浆酶解产物清除DPPH·效果的影响，结果见图4。

由图4 可知，随着酶底比的增加，黑峰蜂王浆球蛋白水解产物清除DPPH·的能力逐渐升高，当酶底比（E/S）为1.5%（质量分数）时清除率最高，随后清除率随之下降，故选1.5%（质量分数）为最佳酶底比。

2.2.2 蜂王浆球蛋白酶解产物抑制亚油酸氧化作用

添加蜂王浆球蛋白酶解产物的亚油酸-NH4SCNFeCl2反应体系吸光度随时间的变化见表2。

表2 添加蜂王浆球蛋白酶解产物的亚油酸-NH4SCN-FeCl2 反应体系吸光度随时间的变化Table 2 The change of absorbency over time of linoleic acid-NH4SCN-FeCl2 reaction system with the addition of Honeycomb globulin enzymatic hydrolysis product

由表2 数据可知，与对照组相比较，不同条件下黑蜂蜂王浆球蛋白酶解产物对亚油酸的氧化均有一定程度的抑制作用，从试验数据判断，在pH 值为7、温度为 27 ℃、反应时间为 3 h、E/S 为 2%（质量分数）的时候对亚油酸的抑制效果最强。

2.2.3 蜂王浆球蛋白酶解产物总抗氧化能力的测定

为考察各蜂王浆提取物在不同条件下酶解物的总抗氧化能力，进行测定试验，如图5 所示。

由图5 可知，不同酶解条件下的新疆黑蜂蜂王浆球蛋白的酶解产物均具有一定的总抗氧化能力，试验数据表明：在反应条件温度为 47 ℃，pH 为 7，E/S 为2%（质量分数），反应时间为3 h 时总抗氧化能力最强。

图5 不同酶解产物总抗氧化能力Fig.5 Total antioxidant capabilities of different enzymatic products

3 结论与讨论

综合以上试验的结果表明，新疆黑蜂蜂王浆中球蛋白的含量约占蜂王浆干重的3.9%。酶解后的蜂王浆球蛋白对DPPH·的清除能力最强的酶解条件是温度为 57 ℃，pH 值为 7.5，E/S 为 1.5%（质量分数），反应时间为4 h。这一结果与总抗氧化能力和抑制亚油酸的氧化结果比较接近，因此可以推断出在黑蜂蜂王浆球蛋白在温度为 57 ℃、pH 值为 7、E/S 为 1.5%（质量分数）、反应时间为4 h 的条件下的抗氧化能力最强。试验结果可为新疆黑峰蜂王浆的综合开发利用提供理论依据和试验数据。