宫颈鳞状细胞癌组织Maspin和Ets-1的表达研究

吉玉洁，尚丹丹,2，尚培中，张 伟，翟佳琪，李 伟，蔡大伟，张利萍

(1.中国人民解放军陆军第八十一集团军医院，河北 张家口 075000；2.河北北方学院研究生学院，河北 张家口 075000)

宫颈癌是女性常见的生殖道恶性肿瘤，其中鳞状细胞癌约占浸润性癌的75%～80%。手术切除和放射治疗是其主要的治疗方式，但治疗期间一些病人可出现复发、扩散及转移，严重影响预后[1-2]。在恶性进展过程中，多种肿瘤标记物参与或发挥了重要作用[3-4]。Maspin(mammary serpin)是一种抑癌基因，其表达下调或缺失与多种肿瘤恶性进展有关。Ets-1(E26 transformation-specific-1)是Maspin 的启动子之一，属Ets转录因子家族，在许多实体肿瘤中异常表达。为了探讨两者在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达状况及其相互关系，本研究应用EliVisionTM plus免疫组织化学两步法检测其在癌组织及癌旁组织中表达的阳性率，探讨它们与患者年龄、癌灶直径、癌细胞间质浸润深度、癌组织分化程度、TNM分期、术前淋巴结转移及术后5年内复发转移的关系，为判断病人预后、指导综合治疗提供有意义的免疫病理指标。

1资料与方法

1.1一般资料

选取中国人民解放军陆军第八十一集团军医院(原中国人民解放军第二五一医院)2008年1月至2013年12月宫颈鳞状细胞癌根治性手术切除标本54例，年龄39～69岁，平均(46.2±5.9)岁，≥46岁34例，<46岁20例。癌灶直径0.5～4.5cm，平均(3.0±1.3)cm，最大径≥3cm 37例，<3cm 17例。癌细胞间质浸润深度≥3mm 45例，<3mm 9例。参照2010年《AJCC癌症分期手册(第七版)》进行TNM分期[5]：Tis期(原位癌，FIGO 0期)3例，T1期(FIGOⅠ期)15例，T2期(FIGOⅡ期)36例。所有患者术前签署知情同意书，研究方案经中国人民解放军第251医院医学伦理委员会审批同意。

纳入标准：研究对象符合下列条件：①手术切除标本均由病理学确诊的Tis期、T1期、T2期宫颈鳞状细胞癌；②术前均未接受化疗、放疗、免疫治疗、靶向治疗等抗癌治疗措施；③无出血倾向及严重内科疾病。

排除标准：下列情况之一予以剔除：①T3期、T4期宫颈鳞状细胞癌；②宫颈腺癌、腺鳞癌以及其它少见的小细胞癌、神经内分泌癌等；③术前曾行化疗、放疗等；④并发其他恶性肿瘤；⑤并发性病；⑥妊娠；⑦其它系统性疾病。

1.2免疫组织化学染色方法

手术标本用10%中性甲醛固定，石蜡包埋，制备4μm厚连续切片，65℃烘烤备用。同时选取距肿瘤3mm癌旁组织30例作为对照[6-7]。

取相邻切片行HE和免疫组织化学染色。鼠抗人浓缩型Maspin单克隆抗体、兔抗人即用型Ets-1单克隆抗体、EliVision试剂盒和3,3’-二氨基联苯胺(DAB)显色剂均购于福州迈新生物技术开发有限公司，其中Maspin按1∶150作为工作浓度。采用微波(MW)仪进行抗原修复。EliVisionTM plus免疫组织化学染色两步法主要操作步骤：①石蜡切片脱蜡至水，MW 5档(90W，下同)，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗1min×3；②MW-枸橼酸钠缓冲液(0.01mol·L-1，pH6.0)修复抗原，MW 3档(150W)2min，MW5档5min×2，自然冷却至室温，自来水冲洗，PBS冲洗1min×3；③MW 5档，甲醇-双氧水中封闭内源性过氧化物酶2min，PBS冲洗1min×3；④加一抗，4℃冰箱过夜；⑤冰箱取出，MW 5档5min，PBS冲洗2min×3；⑥加聚合物增强剂，室温下孵育20min，PBS冲洗2min×3；⑦加生物素化鼠抗人IgG(1∶300)，37℃、30min，MW 5档5min，PBS冲洗2min×3；⑧DAB-H2O2显色10min，自来水冲洗；⑨苏木素复染0.5～1.0min；⑩酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。迈新公司提供的已知maspin和Ets-1阳性染色切片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。

1.3判定标准

背景染色清晰，阳性反应呈黄色、棕黄色或黄褐色颗粒。结果判定由两位病理科医师在5个高倍视野下观察，按染色深浅强度和染色癌细胞所占比例分别评分：①染色强度：不染色计0分，黄色计1分，棕黄色计2分，黄褐色计3分；②染色癌细胞占比：≤5%计0分，6%～30%计1分，31%～69%计2分，≥70%计3分。①+②之和即为每例评分定性结果：0～2分为阴性(-)，3～4分为弱阳性(+)，5～6分为强阳性(++)。弱阳性和强阳性均计为阳性。

1.4统计学方法

数据资料应用SPSS 17.0软件包进行χ2检验及相关性分析，检验水准α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1宫颈鳞状细胞癌组织和癌旁组织Maspin和Ets-1表达的对比分析

宫颈鳞状细胞癌和癌旁组织中，Maspin和Ets-1阳性反应主要见于细胞质，少数见于细胞核，见图1、2。癌组织和癌旁组织中Maspin和Ets-1表达阳性率差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 Maspin和Ets-1在宫颈鳞状细胞癌及癌旁组织中的表达

注：A.Maspin蛋白在宫颈鳞状细胞癌组织表达弱阳性;B.Maspin蛋白在癌旁组织表达强阳性。

图1Maspin蛋白在宫颈鳞状细胞癌组织及癌旁组织中的表达(EliVisionTMplus×100)

Fig.1 Expression of Maspin in cervical squamous-cell and adjacent carcinoma tissues(EliVisionTM plus×100)

2.2宫颈鳞状细胞癌临床病理因素与Maspin和Ets-1表达的对比分析

在年龄≥46岁与年龄<46岁的病人之间对比，Maspin和Ets-1表达阳性率差异均无统计学意义(P>0.05)；在癌灶最大径≥3cm与<3cm的病人之间对比，Maspin表达阳性率差异有统计学意义(P<0.05)，而Ets-1表达阳性率差异无统计学意义(P>0.05)；在术前淋巴结有转移与无转移的病人之间，Maspin表达阳性率差异无统计学意义(P>0.05)，而Ets-1表达阳性率差异有统计学意义(P<0.05)；在癌细胞间质浸润深度≥3mm与<3mm的病人之间、在癌组织高、中、低不同分化程度之间、TNM分期Tis +T1期与T2期的病人之间、细胞核增殖指数Ki-67 ≥75%与<75%的病人之间、以及在术后5年内有复发转移与无复发转移的病人之间，Maspin和 Ets-1表达阳性率差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

注：A.Ets-1蛋白在宫颈鳞状细胞癌组织表达强阳性;B.Est-1蛋白在癌旁组织表达阴性。

2.3宫颈鳞状细胞癌组织中Maspin和Ets-1表达的相关性

54例宫颈鳞状细胞癌组织中，Maspin和Ets-1表达同时阳性者9例，同时阴性者8例，Maspin阳性、Ets-1阴性者11例，Maspin阴性、Ets-1阳性者26例，两者呈负相关(r=-0.30，P<0.05)。

3讨论

体外实验研究发现Maspin基因启动子区域包含一系列转录因子的结合位点，可能与调控Maspin的表达有关，包括Ets、AP-1、HRE、P53等，其中，Ets家族转录因子主要包括Ets-1和Ets-2，两者均有特异的DNA结合序列[8]。本研究选择Ets-1作为检测指标，着重探讨Maspin和Ets-1在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达状况及其相关性，并对比分析两者在几种临床病理因素条件下的表达差异。Ki-67是细胞核增殖标志物，其表达与细胞的增殖活性密切相关，它在多种恶性肿瘤中呈高水平表达，预示肿瘤细胞增殖快，易发生侵袭、转移[4]，因此，本研究同时对比了Maspin和Ets-1与Ki-67表达水平的相关性。

3.1 Maspin表达及其与宫颈鳞状细胞癌临床病理因素的关系

1994年，Zou等应用消减杂交技术对正常乳腺组织和乳腺癌组织进行比较时发现了Maspin基因，证实其为新的丝氨酸蛋白酶抑制剂(mammary serine protease inhibitor)基因，故而命名为Maspin。该基因位于染色体18q21.3，其编码的蛋白质相对分子量为42 000，具有375个氨基酸，与serpin超家族的Ser蛋白激酶抑制物有重要同源性，与卵清蛋白也有31%的同源性。其N端有识别靶蛋白和结合胶原作用的P1残端，C端高度保守，为主要反应部位，发生变异则影响Maspin蛋白功能。Maspin分布在细胞外基质中，其活性与细胞膜相互作用有关。近年研究发现，Maspin蛋白在乳腺、甲状腺、前列腺、结肠等正常组织上皮细胞中广泛表达，但在乳腺癌、胃癌、喉癌等多种恶性肿瘤中呈异常表达，大多数肿瘤癌细胞分化程度越差、TNM分期越晚，Maspin表达阳性率越低；肺癌、卵巢癌等少数肿瘤则与其它肿瘤表达不同，或其复发、转移及预后与Maspin蛋白在细胞质/细胞核表达阳性率比值密切相关，说明其表达部位的不同在一定程度上可反映病变特性[8-9]。近年研究发现，Maspin 在正常宫颈、宫颈上皮内瘤变及宫颈癌组织中的表达水平呈倍数递减，显示它与宫颈肿瘤病情呈负相关性，参与了从原位癌到浸润性癌的发展过程，其表达下调或缺失有利于促进肿瘤微淋巴管生成及癌转移[10-11]。本研究仅将根治性手术切除的早期宫颈鳞状细胞癌作为研究对象，目的是提高研究的针对性和科学性。结果表明，Maspin在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达率明显低于癌旁组织，预示Maspin在良性病变或正常组织中呈高水平表达，而在恶性病变组织中呈低水平表达。对比分析Maspin与宫颈鳞状细胞癌临床病理因素之间的关系时发现，其表达状况与病人年龄及术前淋巴结转移无显著相关性，但癌灶直径越大、癌细胞间质浸润深度越深、分化程度越低、TNM分期越晚，Maspin表达阳性率越低，说明Maspin表达与宫颈鳞状细胞癌的恶性发展呈显著负相关性。同时，Maspin在Ki-67高表达病人中的阳性率显著低于Ki-67低表达病人，表明Maspin与Ki-67呈显著负相关性，推测Maspin的低表达预示着宫颈鳞状细胞癌生长速度快、侵袭力强。随访调查发现，术后5年内有复发转移甚至死亡者，Maspin表达阳性率明显低于无复发转移者，说明Maspin低表达预示病人预后不良。

3.2 Ets-1表达及其与宫颈鳞状细胞癌临床病理因素的关系

Ets-1基因位于染色体11q23，其编码的蛋白质相对分子量为54 000，具有440个氨基酸，参与调节一系列与细胞外基质重塑、降解有关的基因表达，如基质金属蛋白酶-1、3、9，尿激酶型纤维蛋白溶酶原活化物，整合素β-2等，这些物质可使细胞黏附能力降低，有利于癌细胞游走、浸润、生长和转移[12-13]。近年研究发现，Ets-1蛋白在胃癌、结直肠癌、膀胱癌、子宫内膜癌等多种癌组织中呈表达上调，在卵巢癌癌组织中呈表达下调[14-15]。Fujimoto等[16]发现在宫颈癌组织中Ets-1表达主要分布在癌组织血管内皮细胞及其之间的缝隙连接处，且临床分期越晚，Ets-1表达水平越高。本研究结果显示，Ets-1在宫颈鳞状细胞癌组织中表达率明显高于癌旁组织，预示Ets-1在良性病变或正常组织中呈低水平表达，而在恶性病变组织中呈高水平表达。其表达状况与病人年龄及癌灶大小无关，但癌细胞间质浸润深度越深、分化程度越低、TNM分期越晚、术前淋巴结转移越多，Ets-1表达阳性率越高，说明Ets-1参与了宫颈组织由良性到恶性发展的不良分化过程，高表达病人更易发生淋巴结转移，根据其表达水平有助于更准确地临床病理分期。同时，Ets-1在Ki-67高表达病人中的阳性率显著高于Ki-67低表达病人，表明Ets-1与Ki-67呈显著正相关性，推测Ets-1的高表达预示着宫颈鳞状细胞癌侵袭力强、易发生淋巴结转移。随访调查发现，术后5年内有复发转移甚至死亡者，Ets-1表达阳性率明显高于无复发转移者，说明Ets-1高表达预示病人预后不良，生存期短。

3.3 Maspin和Ets-1表达的相关性及其意义

Maspin是PI3K/AKT和TLR4/NF-κB信号通路相关分子之一[17]。资料显示，Maspin能够直接抑制培养基中血管内皮细胞向碱性纤维生长因子和血管内皮生长因子转化，进而抑制癌细胞有丝分裂和癌灶血管生成。然而，有丝分裂信号可使Ets-1磷酸化，抑制其DNA结合活性。Ets-1作为转录因子，主要通过转录激活癌症相关基因表达，与其他转录因子一样拥有相同或相似的信号通路。本研究结果显示Maspin与Ets-1之间呈显著负相关，可见两者之间存在信号传导进而相互调节，其机制可能与Maspin启动子区域结构有关。因此，Maspin和Ets-1都有望成为选择性基因抑制治疗的潜在分子靶点。进一步研究将有助于深入了解两者在宫颈癌发生发展中的作用机制及其与其他因子相互调节原理，从而实现对宫颈癌的早预防、早检测、早诊断、早治疗。

综上，在宫颈鳞状细胞癌组织中，Maspin蛋白表达低于癌旁组织，而Ets-1蛋白表达高于癌旁组织。癌灶直径越大、癌细胞间质浸润深度越深、分化程度越低、TNM分期越晚、以及术后5年内复发转移者，Maspin蛋白表达阳性率越低，而Ets-1蛋白表达阳性率越高，两者表达呈显著负相关，且与Ki-67分别呈显著负相关和正相关，表明它们可能共同参与了宫颈鳞状细胞癌的发生和临床恶性进展过程。