IGF-1/IGF-1R在大鼠梗死心肌组织中的表达与干预

于俊民，张小波，李大鹤，王慧冬，赵园园，沈伟伟

胰岛素样生长因子（IGF-1）是重要的心源性激素，参与机体整个动脉粥样硬化形成过程。IGF-1通过与分布体内多种组织、器官的胰岛素样生长因子-1受体（IGF-1R）结合，在冠心病、内分泌疾病、恶性肿瘤及肝、肾、心肌纤维化等疾病的发生发展中起重要作用。心肌纤维化（MF）是由于心肌胶原纤维过量沉积及比例失调最终导致心功能不全的一种病理变化，是心肌梗死后恶性心律失常的关键影响因素[1]，如何调控MF的发展进程，对于改善心肌梗死（MI）预后具有重要的临床意义。血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（ARB）在改善梗死后心肌纤维化方面的作用已得到证实，前期研究发现厄贝沙坦可影响老年非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI）患者血中TGF-β1、CTGF的水平[2]，但厄贝沙坦对心肌梗死患者血中及组织中IGF-1、IGF-1R的影响尚未见报道。实验通过观察大鼠心肌梗死后心肌组织中IGF-1、IGF-1R的表达，并给予厄贝沙坦干预，进而探讨IGF-1、IGF-1R对心肌梗死预后的影响，为心肌纤维化防治提供临床依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料清洁级Wistar雄性大鼠（哈尔滨医科大学动物实验中心提供）；实时PCR仪（ABI 7500）；IGF-1、IGF-1R及GAPDH引物（TaKaRa）；RT试剂盒（Promega）；抗IGF-1抗体、抗IGF-1R抗体（Abcam）；抗GAPDH抗体（CST）；裂解液Trizol reagent（Invitrogen）；HRP标记的Ⅱ抗（碧云天）；RIP组织细胞快速裂解液（Solarbio）；BCA蛋白定量试剂盒（Thermo）；NC膜（Millipore）；厄贝沙坦（商品名：安博维；德国赛诺菲制药公司）。

1.2 心肌梗死模型的制备大鼠称重，以1%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，气管插管后连接小动物呼吸机有氧正压通气。于左侧胸腔第4肋间逐层开胸，开放心包后挤压右侧胸腔使心脏暴露于胸腔外，用丝线结扎左冠状动脉前降支后，将心脏放回正常位置，并逐层缝合胸腔。恢复自主呼吸后拔管，保温待其清醒。假手术组，采用相同的方法开胸、穿线，仅在冠状动脉下留置丝线，不结扎，余与制模组相同。

1.3 实验分组选择建模后24 h存活大鼠随机分为药物组（n=9）、对照组（n=9），另设假手术组（n=9）。药物组给予厄贝沙坦50 mg·kg/d，连续4周，对照组及假手术组给予等体积生理盐水灌胃，每天1次，4周后处死。

1.4 大鼠左心室重量测定4周时大鼠称重，3%戊巴比妥30 mg/kg腹腔麻醉，心腔内注射10%氯化钾使心脏停跳于舒张期，称取左心室重量。

1.5 心肌病理改变大鼠心肌组织常规脱水、石蜡包埋、切片，切片脱蜡，二甲苯透明，苏木精-伊红染色（HE）染色，光镜观察各组大鼠的心肌组织形态学变化。

1.6 IGF-1、IGF-1R mRNA检测应用Real-time PCR方法检测各组大鼠心肌组织中IGF-1、IGF-1R mRNA水平。提取各组大鼠心肌组织，按照Trizol试剂盒操作步骤进行RNA提取 ，然后反转录合成cDNA ，将制备好的cDNA进行PCR扩增，数据采用仪器自带ABI Prism 7300 SDS Software分析。实时定量PCR的数据应用2-△△Ct方法计算。

IGF-1的上游引物序列5’-GCACTCTGCTTGCTC ACCTTTA-3’，

下游引物序列为5’-TCCGAATGCTGGAGCCATA-3’；

IGF-1R的上游引物序列为5’-GGTCTCTAAGGC CAGAGGTGGA-3’，

下游引物序列为5’-GACGAACTTGTTGGCATTG AGGTA-3’；

GAPDH的上游引物序列为5’- GGAGATTACTGC CCTGGCTCCTA-3’,

下游引物序列为5’-GACTCATCGTACTCCTGCTT GCTG-3’。

1.7 IGF-1、IGF-1R蛋白检测将新鲜组织剪成碎片，按每20 mg组织加入150～250 μl裂解液比例加入裂解液，匀浆器匀浆直至完全裂解。裂解后的样品4℃12 000×g离心15 min，取上清，进行蛋白质定量，采用半干式转膜仪进行转膜，甲醇活化后用TBST洗后进行封闭。封闭后进行I抗孵育，根据说明书IGF-1 1:2500、IGF-1R 1:500稀释抗体，抗体加入封闭液中稀释到所需浓度，和膜室温孵育2 h。孵育I抗的膜用TBST洗涤5 min×3次。随后根据用量，按照1:1500稀释HRP标记的Ⅱ抗，与膜37℃孵育1 h。用TBST洗涤5 min×3次。最后采用ECL化学发光检测显色条带强弱。以目的蛋白条带的强度与内参照蛋白强度的比值代表目的蛋白的相对表达量。

1.8 统计学处理应用SPSS 17.0软件进行统计学分析。实验数据均以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌病理变化HE染色可见假手术组心肌细胞排列规则，对照及药物组心肌细胞排列紊乱，心肌细胞肿胀、断裂，细胞核溶解，炎性细胞浸润，药物组改变较对照组减轻（图1）。

2.2 大鼠左心室重量各组大鼠体重无统计学差异（P均＞0.05）；左心室重量的比较中，药物组和对照组高于假手术组，对照组高于药物组，差异均有统计学意义（P均＜0.05）（表1）。

2.3 大鼠心肌组织IGF-1、IGF-1R的mRNA及蛋白表达大鼠心肌组织中均可检测到IGF-1、IGF-1R的mRNA及蛋白水平。药物组及对照组IGF-1、IGF-1R mRNA及蛋白含量均高于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05）；药物组IGF-1、IGF-1R mRNA及蛋白水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2、图2）。

图1 各组大鼠心肌组织HE染色（×400）

表1 各组大鼠体重、左心室重量情况

表2 各组大鼠IGF-1、IGF-1R的mRNA及蛋白的表达情况

图2 大鼠缺血心肌IGF-1、IGF-1R蛋白表达

3 讨论

IGF-1作为胰岛素家族的一类多肽，是一种多功能细胞增殖调控因子。有学者认为IGF-1参与新生心肌纤维的增殖，在成熟心肌细胞中具有加强心肌纤维生长的功能[3]，同时IGF参与多种心脏生理病理过程，在急性心肌梗死的发生发展中有重大意义[4]。胰岛素样生长因子-1受体普遍分布于心血管系统，属于酪氨酸蛋白激酶传导系统，由4个亚基组成，主要接受IGF-1的刺激。IGF-1与IGF-1R结合后可激活多种信号通路，对心肌纤维化和心肌肥厚起到调节作用。

心肌纤维化在心室重构的过程中会导致心肌功能、代谢、传导异常，发展成为心力衰竭、心肌疾病及各种心律失常等心脏疾病[5]。心肌梗死后心室重塑、心肌纤维化，肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS系统）的激活，血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）与血管紧张素转换酶1（AT1）型受体结合，介导心室重塑过程中一系列生物化学反应。ARB在受体水平完全阻断血管紧张素作用降低末梢血管阻力，抑制肾上腺分泌醛固酮，改善舒张功能，防止心室重构。心肌梗死后心肌局部AngⅡ增加，导致胶原合成增加，加速心肌纤维化的进程[6]。厄贝沙坦能够有效抑制AngⅠ向AngⅡ的转换，同时对AT1也具有特异性拮抗作用[7-9]。

有文献报道厄贝沙坦可以通过下调基质金属蛋白酶2（MMP2）、基质金属蛋白酶抑制因子2（TIMP-2）表达,调节细胞外基质（ECM）的降解和合成，减轻高血压导致的心室肌纤维化[10]，在心肌梗死后重构早期阶段的抗炎作用可以改善心肌梗死预后[11]，另有报道缬沙坦可以抑制AngⅡ的释放，降低MMP-2和基质金属蛋白酶9（MMP-9），从而减少胶原蛋白的累积，防止心肌纤维化的进展[12]，Tang等观察到糖尿病大鼠经厄贝沙坦干预后减轻糖尿病心肌病的损伤程度[13]。本实验通过建立大鼠心肌梗死模型，给予厄贝沙坦治疗4周后发现药物组大鼠心肌病理变化明显改善，且左心室重量明显低于对照组，证实了厄贝沙坦对心肌梗死后大鼠缺血心肌的保护作用。

Galie等[14]通过对大鼠心肌纤维化模型观察，发现缺氧诱导成纤维细胞使IGF-1和血管内皮生长因子分泌显著增加，以促进缺血心肌形成旁分泌环境，介导纤维化过程。心肌梗死后心肌缺血性损伤刺激心肌细胞合成炎症细胞因子，同时梗死心肌释放多种抗原引发自身免疫反应促使炎症发生。急性炎症是纤维化的起始，随后发生的信号转导、氧环境改变等上调纤维化相关基因的表达[15]，有研究发现炎性因子可促进上皮细胞表达IGF-1、IGF-1R[16]，有学者证实IGF-1介导的信号通路与肾素-血管紧张素系统（RAS）在心室重塑的过程中存在协同作用[17]。实验观察到心肌梗死大鼠应用厄贝沙坦治疗4周后，药物组及对照组大鼠心肌组织中IGF-1、IGF-1R mRNA及蛋白水平明显高于假手术组，且药物组IGF-1、IGF-1R mRNA及蛋白明显低于对照组，表明厄贝沙坦可以调控大鼠梗死心肌组织中IGF-1、IGF-1R mRNA、蛋白表达，抑制IGF-1、IGF-1R水平，从而推测IGF-1、IGF-1R参与了厄贝沙坦对缺血心肌的保护作用。

心肌纤维化已成为研究心肌梗死后心力衰竭的治疗靶点。心肌梗死后胶原降解过度，异常胶原沉积，广泛心肌纤维化使心室壁硬度增加，顺应性减低，影响心脏的收缩和舒张功能，最终导致心力衰竭的发生[18,19]。曾有学者报道高血压患者外周血IGF-1水平与其心血管重构具有紧密联系[20]，充血性心力衰竭时IGF-1介导并参与心肌重构[21]，以往研究证实厄贝沙坦可影响大鼠缺血心肌组织中肝细胞生长因子（HGF）水平[22]，本实验观察到厄贝沙坦同时可抑制梗死大鼠心肌组织IGF-1、IGF-1R mRNA及蛋白表达，表明IGF-1/IGF-1R信号通路与其他炎症因子共同参与了心肌梗死后心室重构心肌纤维化过程，从分子水平为心肌梗死后心肌纤维化机制的研究奠定了基础，为厄贝沙坦的临床应用提供理论依据。由于本实验样本量较小，在心肌梗死后心肌纤维化的过程中，是否存在细胞因子与信号通路间的相互影响尚需进一步探讨。