神经丝蛋白轻链多肽在神经纤维瘤病变组织中的表达及意义

牛学强，刘 洋，刘福云，胡伟明

神经纤维瘤(Neurofibromatosis，NF)是一种常染色体线性遗传病，肿瘤成分主要由雪旺氏细胞、周神经细胞和成纤维样细胞等组成，细胞外间隙由大量胶原纤维沉积，根据临床表现及基因型定位分为NF1和NF2两种亚型[1]。I型神经纤维瘤(neurofibromatosis type 1，NF1)是临床上一种神经皮肤综合征，目前临床多以手术治疗、放化疗等手段进行治疗，但无法彻底治愈[2]。因此寻找NF1发生发展中的标志性生物分子，研究NFI发生发展机制对患者靶向治疗具有重要意义。神经丝轻链多肽(neurofilament light-chain polypeptide，NEFL)是细胞骨架的关键成分，可与细胞塑形相关蛋白发生联系发生作用[3]。研究报道，NEFL特异表达于神经组织，其异常表达或甲基化变异与腓骨肌萎缩并、脱髓鞘疾病等多种运动神经元疾病及肿瘤有关，但表达机制尚不清楚，另NEFL与NF1的关系尚鲜有研究[4～6]。因此本研究拟检测NF1瘤变组织中NEFL表达水平，以探究其临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析2017年1月～2019年6月本院收治的I型神经纤维瘤(NF1)患者34例为研究对象，收集手术或病理活检切除的神经纤维瘤瘤变组织，患者年龄范围不限，男性16例，女性18例。另取因整容或其他皮肤疾病手术患者术中切除的正常皮肤组织34例，患者年龄与神经纤维瘤患者相匹配，男性15例，女性19例。两组患者年龄、性别比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。纳入标准：(1)符合I型神经纤维瘤的诊断标准，皮肤可见6个或以上牛奶咖啡斑，形状大小不一；(2)存在2个或两个以上神经纤维瘤或从状神经纤维瘤；(3)自愿参加本次调查研究。排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤者；(2)临床资料不完整者。本研究经过本院道德伦理委员会批准通过，所有样品采集及资料调查均取得患者及其家属知情同意并签字确认，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2 主要试剂及仪器 Trizol试剂(货号：R0016，上海碧云天)；PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(编号：6210A)、TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(编号：RR820A)购自TaKaRa生物公司；引物由上海吉玛生物科技有限公司合成；蛋白抽提试剂盒(批号：P0028)、BCA蛋白定量试剂盒(批号：P0010S)，购自上海碧云天有限公司；一抗兔源NEFL(货号：ab223343)、CTGF(货号：ab231824)、TGF-β1(货号：ab92486)、β-actin(货号：ab8227) 抗体购自英国Abcam公司；二抗羊抗鼠IgG，羊抗兔IgG(货号分别为B-2752，15135，美国Invitrogen)，紫外分光光度计(美国 Thermo 公司) 、RT-qPCR仪7500(美国Bio-Rad公司)、MODEL550型酶标仪等。

1.3 方法

1.3.1 NEFL、CTGF、TGF-β1 mRNA水平检测 采用Trizol提取NF1瘤变及正常皮肤组织总RNA，用紫外分光光度计检测总 RNA 浓度及纯度。反转录得到cDNA，置于-20 ℃保存备用。采用(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)检测NEFL、CTGF、TGF-β1 mRNA表达水平。RT-qPCR采用20μl反应体系：TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×) 10 μl，ROX Reference Dye or Dye II(50×)0.4 μl，cDNA(50 ng/μl)2 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，ddH2O 6.0 μl。反应采用两步法，条件设置为：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，34 s，40个循环；添加溶解曲线。NEFL上游引物序列(5’→3’)为：GAA GAG GAG GCA GCT GGA AGA，下游引物序列(5’→3’)为：AAG GAA ATG GGG GTT CAA TC；CTGF上游引物序列(5’→3’)为：AAC TAT GAT TAG AGC CAA CTG CCT G，下游引物序列(5’→3’)为：TCA TGC CAT GTC TCC GTA CAT CTT C；TGF-β1上游引物序列(5’→3’)为：CTT CAG CTC CAC AGA GAA GAA GAA CTG C，下游引物序列(5’→3’)为：CAC GAT GAT GTT GGA CAA CTG CTC C； 内参β-actin上游引物序列(5’→3’)为：GTC GAT GGC TAG TCG TAG CAT CGA T，下游引物序列(5’→3’)为：TGC TAG CTG GCA TGC CCG ATC GAT C。采用2-△△CT法对NF1瘤变及正常皮肤组织中NEFL、CTGF、TGF-β1 mRNA的相对表达水平进行定量分析。

1.3.2 NEFL、CTGF、TGF-β1蛋白水平检测 采用蛋白抽提试剂盒提NF1瘤变及正常皮肤组织总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度，置于-80 ℃保存备用。取60 mg蛋白样品，于80 mV电压下6%十二烷基硫酸钠-聚丙烯凝胶酰胺(SDS-PAGE)电泳2 h，250 mA下PVDF膜转膜70 min。采用含5%脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液(PBS)室温封闭 2 h，加入适量含2%脱脂奶粉的PBS稀释，加一抗(NEFL、CTGF、TGF-β1抗体 1∶500；GAPDH抗体 1∶500)4 ℃孵育过夜，TBST 缓冲液洗膜 3 次，每次 20 min，用适量含2%脱脂奶粉的PBS稀释辣根过氧化物酶标记的二抗IgG(1∶5000)室温孵育 1.5 h，按上述方法洗膜，用免疫印记化学发光试剂(ECL)显色，数字化多功能图像增强化学发光系统曝片，观察结果并进行分析。

2 结 果

2.1 NEFL mRNA及蛋白在NF1瘤变组织及正常组织表达情况比较 与正常皮肤组织比较，NF1瘤变组织中NEFL mRNA及蛋白表达水平均显著增加，差异有统计学意义(P>0.05)(见图1，表1)。

2.2 CTGF和TGF-β1 mRNA及蛋白在NF1瘤变组织及正常组织表达情况比较 与正常皮肤组织比较，NF1瘤变组织中CTGF和TGF-β1 mRNA及蛋白表达水平均显著增加，差异有统计学意义(P>0.05)(见图2、表2)。

2.3 NF1患者瘤变组织中NEFL蛋白表达水平与CTGF、TGF-β1蛋白水平的相关性 Pearson相关性分析结果显示，NF1患者瘤变组织中NEFL蛋白表达水平与CTGF、TGF-β1蛋白水平均正相关(r=0.471、0.610，P<0.05)(见图3)。

A：正常皮肤组织；B：NF1瘤变组织

A：正常皮肤组织；B：NF1瘤变组织

图2 WB检测NF1瘤变组织及正常组织中CTGF和TGF-β1蛋白表达

左图：NEFL与CTGF蛋白表达水平的相关性；右图：NEFL与TGF-β1蛋白表达水平的相关性

图3 NF1患者瘤变组织中NEFL蛋白表达水平与CTGF、TGF-β1蛋白水平的相关性

表1 NEFL mRNA及蛋白在NF1瘤变组织及正常组织表达情况比较

表2 CTGF和TGF-β1 mRNA及蛋白在NF1瘤变组织及正常组织表达情况比较

3 讨 论

神经纤维丝包括NEFL、神经丝中链多肽及神经丝重链多肽3个亚型，其中NEFL是唯一可以自我组装的亚单位，大量表达于轴突白质中，在维持神经细胞形态及使有髓鞘的轴突再生方面发挥重要作用[7]。NEFL编码基因位于常染色体8p21，这一区域富含抑癌基因，且此区域是与多种癌症发生机制有关的基因失杂合性多发区[8，9]。李全春等[10]研究报道，NEFL在轴索中高表达，神经元损伤后，NEFL进入细胞外液，导致颅脑损伤患者血清NEFL水平显著高于正常对照组，且不良预后组血清NEFL水平高于预后良好组。研究报道[11，12]，NEFL在脑胶质瘤多形性细胞瘤组织及细胞中均显著下调，是miR-183、miR-25的直接靶基因，可通过mTOR信号通路促进脑胶质瘤多形性细胞瘤细胞的增殖和侵袭。Sainio等[13]研究报道，早期发作的神经病年腓骨肌萎缩病患者的特异性神经元内缺乏NEFL。本研究结果发现，与正常皮肤组织比较，NF1瘤变组织中NEFL mRNA及蛋白水平均显著升高，推测NEFL正常情况下特异表达于神经组织，在皮肤组织中几乎无表达，瘤变组织NEFL异常增加可能与NF1发生有关。

神经纤维瘤发源于雪旺氏细胞NF1基因的突变、缺失或不表达，NF1基因异常不仅导致细胞本身的癌化，还可使组织中神经纤维素浓度降低，导致神经细胞及其它细胞间微环境失衡，破坏雪旺氏细胞与肥大细胞的负反馈机制，引起肥大细胞向肿瘤组织迁移并分泌转化生长因子-β(Transforming growth factor-beta，TGF-β1)，促进纤维母细胞增殖，导致组织纤维沉积增加[14，15]。神经纤维瘤的病理显示有大量梭形细胞和成纤维样细胞等沉积，结蹄组织生长因子(Connective tissue growth factor，CTGF)是主要致纤维化因子和TGF-β1的直接下游效应分子，可促进成纤维细胞增殖、细胞外基质沉积，刺激胶原合成[16，17]。余文林等[18]研究报道，NF组织中CTGF、TGF-β1 mRNA水平及蛋白阳性表达率均显著高于瘢痕疙瘩及正常皮肤组织，可促进神经纤维瘤发生发展。本研究结果发现，CTGF和TGF-β1 mRNA及蛋白在NF1瘤变组织中表达水平均高于正常皮肤组织，且与NEFL呈正相关，提示NEFL可能通过纤维化作用，与NF1发生发展有关。

综上所述，NEFL在I型神经纤维瘤组织中高表达，可能通过组织纤维化参与NF1发生发展。由于此病发病率低，样本采集不易，本研究纳入患者较少，可能结果具有局限性，另关于NEFL参与NF1发生发展的具体作用机制及相关作用分子及通路尚不清楚，有待进一步深入探究。