口腔鳞癌中结合珠蛋白与肿瘤血管生成的初步研究

魏亚茹 吴健 段晓峰 高琼 瞿泽丰

口腔鳞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）占口腔恶性肿瘤的80%［1］。OSCC与慢性刺激因素（如烟草，吸烟，酒精和嚼槟榔）有关［2］。其致死原因主要是局部复发及全身转移。据WHO统计，每年全世界新增口腔颌面部恶性肿瘤患者中，发展中国家超过32万人，死亡近9万人［3-4］。我国人口基数大，据统计每年新发病例约4.56万人，且近年发病率呈上升趋势。所以口腔颌面部恶性肿瘤的防治不容忽视［3，5］。虽然目前手术切除是治疗OSCC最好的办法，但是根治性切除，术后5年的复发率仍较高，生存率＜50%，精准治疗是未来推崇的趋势，通过基因组或蛋白质组学高通量技术发现的新生物标志物或生物标志物模式能够对某些人类疾病，特别是恶性肿瘤进行更可靠的早期诊断。本课题组前期研究发现［6］，结合珠蛋白（haptoglobin，Hp）在口腔鳞癌血清中的表达高于健康人的血清，这表明触珠蛋白可能成为口腔鳞癌的血清肿瘤标记物之一。目前，肿瘤血管生成的及抗血管生成的研究是治疗肿瘤的一个新方向。因此，本文旨在研究结合珠蛋白在口腔鳞癌和健康人组织中的表达差异，并探讨结合珠蛋白在口腔鳞癌中与血管生成的关系。

本研究采用Western blot技术，比较Hp在口腔鳞状细胞癌和健康人组织中的表达差异，再应用免疫组织化学染色的方法标记血管内皮细胞，观察Hp在血管周围的分布情况，用Weidner校正法计数微血管密度（microvessel density，MVD）。分析在口腔鳞状细胞癌中，结合珠蛋白与血管生成的关系，为临床应用抗血管生成来治疗肿瘤提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究标本 标本来源于贵州医科大学附属医院口腔颌面外科手术，未采用针对肿瘤的治疗如手术、放疗、化疗等，且经病理证实的口腔鳞癌组织标本30例，对照口腔黏膜组织标本30例。口腔鳞癌组织标本来源情况：男性23例，女性7例，年龄45～75岁，平均年龄60.2岁；其中高分化鳞癌21例，中分化鳞癌9例；对照口腔黏膜组织标本来源于拔牙病人，体检健康，既往无肿瘤史。

1.1.2 主要试剂 兔抗人Hp单克隆抗体（ab13123-6，1∶6 000，Abcam公司，英国）、内参鼠抗人GAPDH单抗（HRP-60004，1∶2 000，三鹰公司）、HRP标记的羊抗兔二抗（GTX213110-01，1∶5 000，Gene Tex公司，美国）、0.22μm PVDF膜、一抗稀释液、二抗稀释液、BSA封闭液、BCA蛋白定量试剂盒［PierceTMBCA Protein Assay Kit（Prod＃23227），赛默飞，美国］；SDS-PAGE凝制胶试剂盒［P0012A，北京索莱宝（Lot.No.2016042-1）］；ECL-Plus发光试剂（Millipore Immobilon Western公司，美国）等；兔抗人Hp单克隆抗体（1∶100，Gene Tex公司，美国）；鼠抗人CD31单克隆抗体（1∶200）、山羊血清封闭液（ZLI-9022）、内源性过氧化物酶阻断剂（BF06097）、Polymer双染检测试剂盒（DS-0001）（中杉金桥公司）等。

1.1.3 主要实验仪器 -80℃冰箱（TSX2305GA，赛默飞，美国）；酶标仪（ELx800，Bio-Tek，美国）。显微镜（TE2000-U，Nikon公司，日本）；超净工作台（SWCJ-1F，济南博涵生物科技有限公司）、石蜡切片机（RM2235，Lecia，德国），Exceed-AC-08型超纯水仪（Exceed-AC-08，成都艾科有限公司）等。

1.2 实验方法

1.2.1 Western blot免疫印迹法 所有标本-80℃保存待用。提取蛋白时，于冰上切取大小约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm组织置于1.5 mlEP管中，加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，置于冰块上进行手动研磨直组织彻底溶解，于高速离心机中以12 000 r／min，4℃高速离心15 min后，取上清液，弃沉淀物。BCA法测定总蛋白浓度、变性蛋白；制胶、电泳；转膜，结束后TBST洗3次，5 min／次；室温封闭1.5 h；一抗兔抗人Hp单抗4℃冰箱过夜孵育；TBST洗3次，8 min／次，结束后羊抗兔二抗室温孵育1 h；TBST洗3次，8min／次，结束后加入ECL发光液显色，化学发光仪曝光显色，用Image-Pro Plus进行图像数据分析。

1.2.2 免疫组织化学染色法 所有OSCC组织及口腔正常组织首先均经中性甲醛固定，然后进行石蜡包埋和连续切片（5μm）。60℃烤片1 h；脱蜡、水化；灭活内源性过氧化物酶和碱性磷酸酶活性15 min；柠檬酸盐缓冲液抗原修复20 min，室温冷却，PBST洗3次，5 min／次；山羊血清室温封闭1 h；滴加配制好的一抗（鼠抗人CD31单抗1∶100、兔抗人Hp单抗1∶100，二者混匀），4℃过夜；室温复温30 min，PBST洗3次，5 min／次；滴加配置好的二抗（辣根酶标记羊抗鼠IgG聚合物、碱磷酶标记羊抗兔IgG聚合物，二者混匀），室温孵育30 min，PBST洗3次，2 min／次；DAB显色液显色，PBST洗3次，2 min／次；GBI-久红溶液显色，蒸馏水冲洗终止显色；封片。每张切片皆经过半定量计分系统进行评估。先将染色阳性的病理切片置于100倍的镜下观察抗原的表达情况，然后换成400倍的镜下随机选取10个视野，按阳性细胞所占比例进行分级，由2位病理科医生进行盲评。

1.3 统计学处理

采用SPSS 22.0软件对以上数据行χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01差异有显著统计学意义。

2 结 果

2.1 Western blot免疫印迹法结果

Western blot检测30例OSCC及30例对照口腔黏膜组织表达情况见图1。

图1 Western blot检测Hp在口腔鳞癌及对照组组织中的表达Fig 1 Hp expression in OSCC and control tissues examined by Western blot

2.2 免疫组织化学染色结果

Hp主要位于OSCC细胞间质中，呈红色；CD31定位于血管内皮细胞细胞膜，呈棕黄色。在OSCC中可见大量的微血管存在，血管呈条索状、点状、出芽状及血管内皮细胞呈族状聚集；对照组织中微血管明显减少。Hp均围绕着血管分布，在OSCC中高表达，染色深；对照组织中低表达，染色浅（图2）。OSCC组织中Hp的表达明显高于对照组织（P＜0.01）（表1）。

Hp表达与OSCC临床病理学参数的关系见表2。不同组织学分级的口腔鳞癌间质中，其Hp的表达率有明显的差异，分化程度越低者，Hp表达率越高，差异有统计学意义（P＜0.05）；Ⅲ～Ⅳ期中Hp的表达较Ⅰ～Ⅱ期明显升高，差异有统计学意义，P＜0.05；但Hp的表达与患者年龄、性别、无显著关系（P＞0.05）。

图2 Hp在对照口腔组织及口腔鳞癌组织中的表达（免疫组化，×400）Fig 2 Hp expression in control oral tissue and OSCC（IHC，×400）

表1 口腔鳞癌组织及对照组织中Hp的表达 （n＝30）Tab 1 Hp expression in OSCCand control tissues（n＝30）

OSCC中Hp的表达与微血管密度（MVD）的关系见表3。OSCC中Hp阳性表达的MVD高于Hp阴性者（P＜0.05）。

表3 OSCC中Hp的表达与MVD的关系Tab 3 The relationship between Hp expression and MVD in OSCC

3 讨 论

口腔鳞状细胞癌是一类严重危害人类健康的恶性肿瘤，占口腔恶性肿瘤的80%，在头颈鳞癌（HNSCC）中也占较大比例，死亡率极高。传统的手术、放疗、化疗因其各自的局限性而不能达到满意的疗效。虽然目前手术切除是治疗OSCC最好的办法，但是根治性切除，术后5年的复发率仍较高，生存率＜50%［7］。因而研究新的抗肿瘤治疗的靶点就显得尤为重要。

Hp由Polonovski和Jayle首次发现，是一种分子量为85 000的急性期反应蛋白［8］。Hp又叫触珠蛋白，是血清α2球蛋白组分中的一种酸性糖蛋白，广泛存在于人类和许多哺乳动物的血清及其他体液中。主要功能是通过与血清中游离的血红蛋白结合，形成稳定的结合珠蛋白-血红蛋白复合物，将血红蛋白转运至肝脏中代谢，从而避免血红蛋白和铁从肾脏丢失及其对肾脏的损伤。此外，还参与宿主抗感染、损伤组织的修复及内环境的稳定，其血清含量在感染、创伤、炎症、肿瘤、心肌梗死等病理状态时显著升高。除以上的功能外，Hp还具有抗氧化、抗菌、抑制前列腺素合成及NO功能、促进血管生成及调节免疫等功能［9］。对肺癌［10］、胰腺癌［11］、肝癌［12］患者血清与正常人血清差异蛋白的研究提示Hp在病理血清中表达上调。蛋白质组学识别Hp作为口腔鳞状细胞癌中的新型血浆生物标志物的研究中发现触珠蛋白水平升高与OSCC临床分期呈强相关（Pb 0.01），表明Hp作为敏感血浆生物标志物具有很大的潜力，可用于早期检测OSCC患者［13］。Hp表达与HNSCC患者复发率的关系研究中发现俩者密切相关，而且多变量分析证实复发风险升高，因此Hp的细胞表达可能是HNSCC中的预后因子［14］。

1979年，Folkman等［15］提出“肿瘤血管生成（angiogenesis，AG）的概念”，发现肿瘤生长分为2个阶段：无血管期和血管期。在无血管期，肿瘤直径处于1～2 mm，此时肿瘤生长依赖于周围原有血管系统通过弥散获得氧和营养物质，这严重的限制了肿瘤细胞的生长及其向远处扩散的可能性；当肿瘤直径大于1～2 mm时，需要诱导生成新的血管来获取血供，否则肿瘤就会因缺血缺氧发生坏死。实体肿瘤的生长及存活依赖血管形成，新生血管通过灌注形式为肿瘤细胞生长提供营养，也是肿瘤细胞代谢产物排泄的有效途径，同时也是肿瘤向远处转移的重要途径。大量研究表明，肿瘤血管生成与肿瘤浸润、转移、及复发密切相关。

本课题组前期通过蛋白质组学的方法建立人OSCC组织与正常口腔组织中的差异蛋白表达，进行质谱鉴定发现Hp在口腔鳞癌外周血清中的表达高于健康人的血清，这表明触珠蛋白可能成为口腔鳞癌的血清肿瘤标记物之一。

实验采用Western blot技术，比较Hp在OSCC和健康人组织中的表达差异，再应用免疫组织化学染色的方法标记血管内皮细胞，观察Hp在血管周围的分布情况，用Weidner校正法计数微血管密度（MVD）［15］。结果提示Hp在OSCC组织中表达显著升高；OSCC中的MVD明显高于正常组织；在OSCC和对照组织中，Hp均围绕着血管分布，且Hp在OSCC中的表达明显较对照组织升高。这表明在OSCC中，Hp的表达可能和MVD呈正相关，Hp对肿瘤的血管生成可能有促进作用。有关它在OSCC中的具体作用，本课题组将在以后的研究中继续探索。目前，肿瘤血管生成的及抗血管生成的研究是治疗肿瘤的一个方向［16］，相信Hp不仅能为OSCC的早期诊断及预后评估提供依据，还能为OSCC的临床治疗提供新的靶点。