高效纤维素降解复合菌系M6的构建及堆肥效果初探

刘青海，潘 虎,，朱兆静，田 云，王 翀，达娃卓玛，卢向阳，白军平

(1.西藏自治区农牧科学院 农业质量标准与检测研究所，西藏 拉萨 850032；2.湖南农业大学 生物科学技术学院，湖南 长沙 410128)

纤维素的结构复杂，单一微生物分泌的酶相对较少，对纤维素的降解效果有限[1-5]。当降解富含纤维素的农业废弃秸秆时，必须协同多种微生物来分解和破坏秸秆表面的蜡质，以利于其内部组分与纤维素酶的接触，加速秸秆的降解，提高生物转化率[6]。目前，关于纤维素降解细菌的报道都集中在单一菌株的分离、纯化及其酶学性质的研究上[7-10]。近年来，在纤维素资源利用研究中逐渐强调了复合菌系的作用[11]。

鉴于此，本研究从西藏农田土壤、长沙稻田腐叶堆积物中筛选纤维素酶高产菌,将能高效分解纤维素的细菌以不同的比例进行复合液体发酵和固体发酵,筛选构建能用于提高堆肥效果的复合菌系,为开发高温好氧堆肥的高效微生物菌剂提供理论依据和技术支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 复合菌系构建所用菌种Z3、Z4、Z6、Z16、Z33、B由湖南农业大学卢向阳课题组采用50 ℃高温驯化手段，从西藏农田土壤、长沙稻田腐叶堆积物中分离筛选。供试菌株经鉴定分别为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)(Z3)、假黄单胞菌(Pseudoxanthomonassp.)(Z4)、芽孢杆菌(Bacillusaestuarii)(Z6)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)(Z16)、台湾假黄单胞菌(Pseudoxanthomonastaiwanensis)(Z33)、温堆芽孢杆菌(Bacillusthermocopriae)(B)。

1.1.2 培养基 种子培养基：蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、NaCl 5g/L、琼脂15 g/L、蒸馏水1 000 mL，调节pH值至7.2～7.4，121 ℃高压蒸气灭菌20 min。发酵培养基：CMC-Na 10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、NaCl 10 g/L、K2HPO41 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、蒸馏水1 000 mL，调节pH值至7.2～7.4，121 ℃高压蒸气灭菌20 min。麸皮培养基：麸皮40%、黄豆粕10%、水50%～60%，pH值自然，124 ℃高压蒸汽灭菌40 min。

1.2 方法

1.2.1 供试菌株间拮抗分析及复合菌系构建 将上述6株高效纤维素降解菌两两交叉，划线于种子培养基上，50 ℃恒温培养箱中倒置培养3 d。如果两菌交叉处形成无菌区，说明它们之间存在拮抗性；如果两菌交叉处无抑菌圈，说明它们之间不存在拮抗性。将无拮抗菌株分别接种至500 mL发酵培养基中，50 ℃、160 r/min恒温摇床培养3 d，离心弃上清后收集菌体，将收集的菌体等质量混合后得到纤维素降解复合菌系M6。

1.2.2 CMC-Na酶活性及滤纸酶活性的测定 CMC-Na酶活性的测定：取经离心且适当稀释的粗酶液0.5 mL于15 mL带有刻度的试管中，另取相同的1份粗酶液0.5 mL，在沸水浴中灭活10 min，作为对照。然后各加入1.5 mL的1% CMC-Na溶液，在50 ℃水浴中预热5 min，然后再在50 ℃水浴放置30 min，让纤维素酶与CMC-Na充分反应。反应后加入3.0 mL的DNS试剂使酶失活，沸水煮沸5 min，使DNS试剂与还原糖反应。冷却后用蒸馏水补充到10 mL，在540 nm波长下测定OD值，重复3次。CMC-Na酶活性=样品中糖含量×稀释倍数/水浴时间，求得酶活性值(1 mL酶液1 min水解底物产生1 μmol还原糖所用的酶量为1个酶活性单位IU/mL)。

滤纸酶活性的测定：向2支试管中分别加入1.5 mL的柠檬酸缓冲液(0.05 mol/L，pH值4.5)，再加入经离心且适当稀释的粗酶液0.5 mL，向其中1支试管中加入1.5 mL DNS试剂，作为对照。然后将2支试管同时放入50 ℃恒温水浴锅中预热5 min，之后分别加入50 mg滤纸条(新星牌定性滤纸，1 cm×6 cm)，再放回50 ℃水浴锅中反应 30 min。取出后向试管中加入1.5 mL DNS试剂，充分混匀后在沸水浴中加热5 min，取出后用蒸馏水定容至10 mL，重复3次，波长540 nm下测OD值(1 mL酶液1 min水解底物产生1 μmoL还原糖所用的酶量为1个酶活性单位IU/mL)。

1.2.3 复合菌系对秸秆降解效率的测定 称取等质量烘干压碎的油菜秸秆，装入250 mL的三角瓶中，用少量的蒸馏水打湿，121 ℃灭菌1.5 h，冷却后将各菌株按10%的接种量接种至灭活过的油菜秸秆，加无菌水至含水率为65%左右，摇荡均匀，使菌体与油菜秸秆充分接触，50 ℃下恒温培养，每2 d晃动1次，观察并记录油菜秸秆降解情况。25 d后将油菜秸秆水洗3次，除去可溶性物质，置65 ℃烘箱中烘干至恒质量，通过质量差计算油菜秸秆降解效率。

1.2.4 固体菌剂的制备与堆肥发酵 根据上述试验结果选取酶活性较高、油菜秸秆降解效果较好的复合菌系M6和菌株Z3，酶活性较低、油菜秸秆降解效果较差的菌株B，不添加任何菌剂的对照(CK)4组处理进行后续堆肥发酵试验。将菌株接种于装有200 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中，50 ℃、200 r/min条件下发酵18 h，菌数达到1×1011～2×1011cfu/mL；然后按2%接种量，无菌操作接种至装有4 kg灭菌固体麸皮培养基的不锈钢浅盘(40 cm×60 cm×5 cm)，用温度计测量固体菌剂发酵期间的温度，重复3次，37 ℃下发酵48 h，气流干燥至含水量介于6%～8%，菌数大于1.5×1011cfu/mL(干质量)，风干后室温保存备用。

堆肥物料以猪粪∶蘑菇渣∶烟沫质量比6∶4∶1的比例进行混合，调节堆肥物料含水率。混合后堆肥物料的理化性质为温度28 ℃、pH值7.4、含水率61%、有机碳含量50.44%、有机质含量86.96%、氮含量1.79%、C/N 28.18。将上述固体菌剂与堆肥物料以质量比1∶50混合，混匀后放置在湖南农业大学生物工程实训基地室内，室内温度控制在23 ℃左右，每周翻堆1次，持续堆肥发酵35 d。每天8:00和18:00记录堆肥物料温度、颜色及气味变化；分别于发酵0 、7 、14 、21 、35 d，在各处理组堆肥物料的上、中、下3个不同部位采集测试样品，将其混均破碎后备用。

1.2.5 堆肥发酵过程中各项指标的测定 堆肥物料温度采用玻璃水银温度计测定；pH值采用NY/T 1377—2007的方法测定；总有机碳含量采用重铬酸钾氧化-分光光度法测定；总氮含量采用凯氏定氮法(HJ 717—2014)测定；全磷含量采用GB/T 9837—1988的方法测定；全钾含量采用NY/T 87—1988的方法测定;记录室温。

1.2.6 种子发芽指数(GI)的测定 称取10 g新鲜堆肥，置于装有100 mL蒸馏水的250 mL三角瓶中，200 r/min、室温振荡2 h、静置，取上清液经滤纸过滤，吸取20 mL于培养皿中，将2张大小合适的新星号定性滤纸平铺于培养皿，待液体完全浸湿后，放入30粒颗粒饱满的山东四号大白菜种子，以蒸馏水作为对照。每个处理重复3次，25 ℃、80%湿度条件下培养48 h后，测定发芽率及根长。最后用下述公式计算GI值并取3次平均值，GI值达到100%表明堆肥完全腐熟且对植物没有毒性。

2 结果与分析

2.1 高温纤维素降解菌株的拮抗性结果

如表1所示，高温纤维素降解菌株Z3、Z4、Z6、Z16、Z33、B拮抗性结果表明，菌株Z16对菌株B有一定的抑制作用；其余菌株之间不存在拮抗性。由于菌株B对其他5菌株生长无影响，且具有一定的纤维素降解能力，故采用菌株Z3、Z4、Z6、Z16、Z33、B进行复合菌系的构建。

表1 6株高温纤维素降解菌株的拮抗性

注：“+ ”表示两菌能够共同培养，不存在拮抗；“- ”表示两菌之间存在或可能存在拮抗。

Note:“+”indicates that the two bacteria can be cultivated together and there is no antagonism;“-”indicates the existence of possible antagonism between the two bacteria.

2.2 CMC-Na酶活性及滤纸酶活性测定结果

在相同条件下测定菌株Z3、Z4、Z6、Z16、Z33、B和复合菌系M6发酵液的CMC-Na酶活性和滤纸酶活性。从图1可见，6株单菌株都可产生并分泌纤维素酶。其中，菌株Z3具有较高的CMC-Na酶活性(1.052 IU/mL)、菌株B具有较低的CMC-Na酶活性(0.172 IU/mL)，菌株Z4有较高的滤纸酶活性(0.366 IU/mL)、菌株Z33有较低的滤纸酶活性(0.165 IU/mL)；而复合菌系M6的滤纸酶活性最高(0.484 IU/mL)，其CMC-Na酶活性(0.823 IU/mL)略低于菌株Z3，但高于其他单菌株，复合菌系M6具有较好的纤维素降解活性。

图1 单菌株和复合菌系M6 的CMC-Na和滤纸酶活性

2.3 复合菌系对油菜秸秆的降解效率

观察单菌株Z3、Z4、Z6、Z16、Z33、B和复合菌系M6对油菜秸秆的降解过程发现，接种各单菌株及复合菌系3 d后，油菜秸秆上均有明显的菌体长出；25 d后，接种复合菌系M6和菌株Z3的油菜秸秆出现明显的腐烂，并伴有降解小颗粒的出现，而不接种菌株的油菜秸秆未出现降解现象。25 d后，接种单株菌的油菜秸秆降解率均达到6.0%以上，接种复合菌系M6的油菜秸秆降解率达16.4%，其纤维素降解效果最佳(图2)。

图2 单菌株和复合菌系M6对油菜秸秆的降解率

2.4 堆肥物料各项指标的测定结果

2.4.1 堆肥物料温度的变化 4组处理的堆肥物料均呈现“升温—高温—降温—稳定”的趋势。堆肥初期，由于堆肥物料中有机物等易分解物质在微生物的作用下快速分解，导致温度迅速升高，3～4 d内达到峰值；随后，堆肥物料进入高温阶段，整个高温阶段约持续1周；高温阶段结束后，堆肥物料温度逐渐降低，堆肥末期，堆肥物料温度趋于恒定室温(图3)。4组处理堆肥物料温度的主要差别在于添加不同菌株可达到的最高温度及高温期(>55 ℃)的持续时间，CK温度峰值(58.2 ℃)较其他处理推迟24 h，且小于其他处理，高温期持续时间也相对较短；而添加复合菌系M6的堆肥物料在堆肥的第3天迅速达到温度峰值(63.7 ℃)，且高于其他3组处理的最高温度，其高温期持续8 d，复合菌系M6处理较其他处理具有较高的温度及较长的高温时间，有利于杀死猪粪中的病原体，促进有机堆肥物料的快速降解与腐熟。

图3 堆肥物料温度的变化

2.4.2 堆肥物料pH值的变化 4组处理在堆肥发酵过程中pH值呈现逐渐升高趋势，堆肥结束后，4组处理堆肥物料pH值稳定在7.8～8.6，呈弱碱性，接种复合菌系M6、菌株Z3和菌株B的3组处理的pH值较CK高(图4)。大量研究表明，长期施用化肥会导致土壤酸化，造成作物生长障碍。本研究结果显示，接种微生物的堆肥物料pH值呈现弱碱性，对酸化土壤具有一定的缓解作用。

图4 堆肥物料pH值的变化

2.4.3 堆肥物料总有机碳含量的变化 由图5可见，堆肥物料总有机碳的含量在发酵0～14 d总体呈快速下降趋势，随后堆肥物料总有机碳含量逐渐进入相对稳定阶段，至堆肥结束，4组处理总有机碳含量维持在32.77%～38.68%。添加复合菌系M6的堆肥物料总有机碳含量由50.44%下降至32.77%，总有机碳含量减少17.67 个百分点；CK堆肥物料总有机碳含量由50.44%下降至38.68%，总有机碳含量减少11.76个百分点；菌株Z3、B处理的堆肥物料总有机碳含量的变化曲线均在复合菌系M6处理和CK之间。上述结果表明，添加高活性复合菌系M6后，有机物的降解速率较快，导致堆肥物料总有机碳含量下降较快，复合菌系M6对有机物的降解效果最佳。

图5 堆肥物料总有机碳含量的变化

2.4.4 堆肥物料总氮含量的变化 由图6可见，随着堆肥时间的延长，堆肥物料中总氮含量呈现先下降后缓慢升高的趋势。堆肥初始阶段，堆肥物料中总氮含量约为1.79%，经过7 d的发酵，4组处理堆肥物料中总氮含量均呈现不同程度降低，堆肥7 d后，堆肥物料全氮含量缓慢升高，发酵结束后稳定在2.23%～2.35%，4组处理堆肥物料中总氮含量均高于起始堆肥物料中的总氮含量。

图6 堆肥物料总氮含量的变化

2.4.5 堆肥物料碳氮比(C/N)的变化 C/N反映发酵期间堆肥物料碳和氮含量的相对变化，是评价堆肥物料腐熟程度的重要参数。一般认为，初始C/N为25～30较好，有利于微生物作用，末期降至15～20表示堆肥物料腐熟程度较好。由图7可见，4组处理堆肥物料C/N均呈现缓慢下降趋势，堆肥物料向着稳定化和腐熟化方向转变，发酵35 d后添加复合菌系M6的堆肥物料C/N最小(14.19)，较发酵初始下降了13.99。由此可见，添加复合菌系M6的堆肥物料较其他处理腐熟程度高。

图7 堆肥物料C/N值的变化

2.4.6 发酵结束后堆肥物料养分含量测定结果 由图8可见，堆肥结束后各处理总氮含量大致相同，介于2.23%～2.35%；复合菌系M6和菌株Z3处理的堆肥物料中五氧化二磷含量较高，而其他处理五氧化二磷含量不足6.00%；各处理氧化钾含量大致相同，介于4.15%～4.37%。综合总氮、五氧化二磷、氧化钾含量，CK、复合菌系M6、菌株Z3、菌株B处理总养分含量分别为11.24%、13.27%、12.60%、11.94%，4组处理总养分含量均达到我国有机肥总养分含量行业标准(有机肥总养分含量≥5.0%)，其中，复合菌系M6处理堆肥物料总养分含量明显高于其他处理，说明添加复合菌系M6的堆肥物料发酵效果较好。

图8 堆肥结束后各处理中养分含量

2.4.7 堆肥物料GI值的变化 由图9可见，随着发酵时间的延长，4组处理的GI值均呈上升趋势。复合菌系M6处理的堆肥物料起始GI值为21%；发酵的前14 d GI值迅速升高，在第14天时已经达到98%；随后，GI值较缓上升直至趋于稳定；堆肥末期，GI值保持在107%；CK堆肥物料GI值的变化趋势总体与复合菌系M6处理相似，但在堆肥末期，其GI值为94%，存在一定的植物毒性。4组处理中，复合菌系M6处理的堆肥物料GI值始终高于其他处理，原因可能是由于复合菌系微生物对堆肥物料中有机质充分降解，堆肥物料腐熟后成分趋于稳定，适合种子的生长发育。

图9 堆肥物料GI值的变化

3 讨论与结论

本研究从西藏农田土壤和长沙稻田腐叶堆积物中筛选出6株高温纤维素降解菌，构建了纤维素高效降解复合菌系M6。复合菌系M6具有较好的CMC-Na酶活性和滤纸酶活性，在50 ℃下发酵25 d时，接种复合菌系M6的油菜秸秆降解率可达16.4%，其纤维素降解效果最佳。崔宗均等[12]筛选并驯化的纤维素分解复合菌系MX1，发酵72 h对滤纸的降解率能够达到94.0%；王伟东等[13]通过限制培养技术驯化了高效纤维素降解复合菌系wsc-6，发酵72 h对滤纸酶的降解率为97.0%，对稻草的降解率为28.2%；张瑞清等[14]研究发现，2种菌株混配可将小麦秸秆的分解率提高到47%，纤维素分解是多种菌株协同作用的结果；刘甲峰等[15]筛选的复合菌系RSS-4，对稻草、纤维素、半纤维素的降解率分别达到45.0%、55.5%、44.1%；王海滨等[16]构建了由微杆菌属、链霉菌属、弗留明拜叶林克氏菌、芽胞杆菌属、毛壳菌属组成的复合菌系，该复合菌系固态发酵20 d后，对稻秆、苦参残渣降解率分别达到63.1%、31.4%，复合菌系显著增加的微生物对纤维素的降解具有促进作用；李静等[17]发现2组复合菌系对玉米秸秆的降解率分别可达31.8%、27.6%，2组复合菌系较单菌株对秸秆的降解率分别提高50.71%、41.54%；牛俊玲等[18]研究表明，在堆肥物料中接种纤维素复合菌系，可以在一定程度上促进堆肥物料中木质素的分解；崔诗法等[19]从枯树叶中筛选出纤维素分解复合菌系St-13，该复合菌系较单一菌株使滤纸酶完全崩解时间大大缩短；邱向阳等[20]研究发现，复合菌系可较快启动滤纸酶的降解过程。本研究结果与上述报道较为一致。

复合菌系M6处理的堆肥物料较其他处理具有较高的温度及较长的高温时间，在堆肥的第3天迅速达到温度峰值(63.7 ℃)，其高温期可持续8 d，有利于杀死猪粪中的病原体，促进有机物料的快速降解和腐熟；李敬波[21]研究发现，微生物复合菌系处理较对照提前1 d达到高温期(>55 ℃)；沈根祥等[22]研究发现，用微生物剂处理堆肥物料，其温度迅速升高，高温期延长2～3 d；竹江良等[23]研究发现，微生物的加入缩短了烟叶废弃物堆肥物料达到高温的时间，延长了热解持续时间，提高了总氮、NH4+-N含量和C/N、GI值升高，提高了烟叶废弃物堆肥物料的成熟程度。

本研究表明，复合菌系M6处理的堆肥物料pH值呈弱碱性，与其他处理差别不明显。堆肥末期，复合菌系M6处理总有机碳含量由50.44%下降至32.77%；其总氮含量由1.79%升高到2.28%；C/N由28.18下降至14.19；堆肥末期，总养分含量为13.27%，高于其他处理；其GI值始终高于其他处理，堆肥末期保持在107%。王伟东等[13]在研究复合菌系对堆肥物料的影响时发现，随着发酵的进行，其C/N由初始的33.5逐步降低到20.0左右，堆肥发酵过程中，复合菌系处理的C/N均低于不接菌处理，接种微生物对堆肥物料的pH值、水分含量和温度影响较小；沈根祥等[22]研究发现，微生物处理较常规处理，可使种子发芽势、作物生长指数和根系建立指数等显著提高，添加微生物菌剂可提高堆肥物料初期微生物的分解速率，降低堆肥物料的植物毒性，使其更易分解；李敬波[21]研究发现，复合菌系对堆肥物料pH值影响较小，其C/N和有机质含量较对照降低，接种复合菌剂可加快堆肥腐熟进程，缩短堆肥物料腐熟时间，提高种子GI值等。上述报道与本研究结果较为一致。木质纤维素在自然界中的降解是真菌、细菌和相应的微生物群落相互作用的结果[24]，复杂的微生物菌群较单一的细菌、真菌和放线菌具有较高的纤维素分解活性[25-27]，本研究构建的复合菌系M6具有较好的纤维素降解能力，复合菌系M6处理的堆肥物料具有较好的腐熟度及品质，对纤维素等有机肥料的降解利用研究具有一定的指导意义，但其不同菌株之间的协同机制仍有待进一步研究探讨。