缺氧环境下健脾消癌方对结肠癌裸鼠的抑瘤作用

宋琳， 蒋益兰

1.江苏省中西医结合医院，江苏 南京 210028；2.湖南省中医药大学附属中西医结合医院，湖南 长沙 410006

结肠癌的发生和复发转移率高，且缺乏有效治疗手段，导致结肠癌患者极高的病死率[1]。据相关资料表明：结肠癌新发病例在全世界男性、女性中分别排名第3位及第2位，死亡率分别排名第4位及第3位[2]。找出结肠癌发病机制中的关键调控分子以及揭示侵袭转移机制对结肠癌的防治具有重要的理论价值。研究表明肿瘤的发生发展、复发及转移与肿瘤所处的微环境密切相关[3]，而缺氧是肿瘤最重要的微环境特点之一。实体肿瘤组织内部普遍存在缺氧环境，缺氧是恶性肿瘤进展的启动因子之一[4-5]。大量体外实验表明缺氧可以促进肿瘤细胞侵袭、转移及肿瘤细胞上皮-间充质化过程[6-7]。临床研究也表明，缺氧与肿瘤生长、复发及转移有关[8]。

随着循证医学和分子生物学的发展，临床肿瘤学进展迅速，中医药作为肿瘤综合治疗的手段之一，以其整体辨证论治、多途径、多靶点的特点，能改善肿瘤缺氧微环境，同时诱导结肠癌细胞凋亡，抑制诱导肿瘤基因表达，抑制癌症细胞迁移，对结肠癌的治疗有一定的疗效[9]。因此，本课题组经长期临床实践，根据结肠癌“虚、毒、淤”的病机特点，以“健脾益气，化瘀解毒”治则创制了经验方健脾消癌方。核心方中以人参、薏苡仁健脾益气，重楼、半枝莲清热解毒，莪术、郁金活血化瘀，全方配伍，扶正抗癌，标本兼顾。既往临床及实验研究已证实健脾消癌方的有效性[10-11]，并且前期实验证实健脾消癌方能下调缺氧微环境中结肠癌细胞缺氧诱导因子-1 水平(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)，间接影响其下游靶基因的表达，抑制结肠癌细胞增殖、促进细胞凋亡、减弱细胞的迁移和侵袭性并提高结肠癌细胞对化疗药物的敏感性，发挥抗癌作用。

本实验模拟缺氧微环境，观察缺氧微环境下健脾消癌方对结肠癌裸鼠生长情况、体重、瘤体体积、瘤重影响以及肿瘤组织病理切片细胞组织变化，证明健脾消癌方对结肠癌的抑瘤有效性。

1 材料和方法

1.1 动物和细胞株

70 只SPF 级BALB/C-nu/nu 裸鼠，体质量(20±2)g，雌雄各半，购自上海斯莱克实验动物有限公司，动物实验符合江苏省中西医结合医院实验动物伦理委员会规定，实验动物生产许可证号为：SYXK(苏)2016-0081。于江苏省中西医结合医院实验动物中心SPF 级层流室饲养，相对湿度40%～60%，12 h 明暗交替进行，自由饮食饮水，定期更换垫料，适应性饲养4周。结肠癌SW620细胞系购自中科院上海细胞研究所，用RPMI1640完全培养基(内含10%小牛血清、1%链青霉素)，在二氧化碳培养箱中传代培养。

1.2 主要试剂和仪器

小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，胰酶消化液、RPMI1640 细胞培养液购自美国Gibco 公司，青霉素、链霉素购自上海国药集团，电子分析天平(AB-204-N；梅特勒托利多有限公司)。

1.3 健脾消癌方

白花蛇舌草30 g，莪术10 g，法半夏10 g，党参15 g，仙灵脾15 g，郁金15 g，黄芪20 g，薏苡仁30 g，半枝莲30 g等。以上药物均根据《中华人民共和国药典》规定的标准由江苏省中西医结合医院中药房采购，实验中所用的同一味药为同一产地同批药材。将以上所有药按5 倍量处方，加8倍量水浸泡30 min，煎煮1 hr，过滤；再加6 倍量水，煎煮1 hr，过滤，合并两次滤液静置24 hr，离心后将上清液压缩至850 ml，4 ℃冷藏48 hr，离心冷藏液得到约800 ml 上清，灭菌后制成1 ml 含2.1 g 生药的水煎剂备用。根据临床推荐用量，70 kg 成人的健脾消癌方为320 g/d，根据预实验设定成人0.0026倍剂量为裸鼠等效剂量，为41.6 g/kg。

1.4 方法及分组

1.4.1 结肠癌细胞接种裸鼠

将结肠癌SW620 细胞正常传代培养，待细胞汇合率达80%时，用胰酶消化并收集细胞，制备成106/ml 的细胞悬液。在超净工作台上，将裸鼠用4%水合氯醛按0.1 ml/10 g 体重麻醉，用碘酒消毒皮肤后，用注射器吸取上述结肠癌细胞悬液100 μl 注射至20 只裸鼠右侧腋部皮下，数天后可在腋下触及小结节，之后皮下移植瘤逐渐增大，3周后肿块大小约1 cm×0.8 cm×0.8 cm，处死裸鼠，无菌操作剥离瘤体后，用生理盐水冲洗后用眼科剪将瘤体剪成1 mm3。将50 只裸鼠用4%水合氯醛麻醉后，用瘤体用18G套管针将上述1 mm3瘤体接种于裸鼠右侧腋部皮下。2周后观察裸鼠右侧腋部皮下肿瘤开始长出，视为造模成功。

1.4.2 分组与处理

取造模成功的50只裸鼠随机分为缺氧组+健脾消癌方组和缺氧组+对照组，每组25只。裸鼠用改装的四面密封的鼠笼饲喂裸鼠(有机玻璃板)，内置垫料、食物、水以及钠石灰布袋(吸收裸鼠呼出的CO2)，盖上盖板，板面有3 个直径1 cm 的气孔，分别用于进气、排气和测氧含量，通入含10.5%O2，89.5% N2的混合气体，气流速度为1.5 L/min，排除湿气和氨气。通过测氧仪监测笼内氧含量，控制在10.5%左右(相当于海拔5 000 m高度的空气含氧量，恒温(25 ± 1)℃，每日更换垫料、补充食物和水分。缺氧组+健脾消癌方组裸鼠采用缺氧环境饲喂，同时根据41.6 g/kg 体重剂量给予裸鼠健脾消癌方，灌胃体积为20 ml/kg，每天1 次；缺氧组+对照组裸鼠缺氧环境饲喂，给予同健脾消癌方组等体积的生理盐水灌胃，每天1 次。连续饲喂4周。

1.4.3 取样和检测指标、方法

干预期间，每天观察裸鼠的一般情况，包括活动情况、饮食、被毛等，每7天测量各只裸鼠的体重及瘤体体积。末次给药24 h 后，处死裸鼠，取出移植瘤，用0.9%NaCl冲洗，称量瘤重，将移植瘤组织切成小块，分成两份：一份迅速冻存于-80 ℃冰箱内；另一份固定于4%多聚甲醛中。游标卡尺定期测量裸鼠移植瘤的长径和短径，计算肿瘤体积(V)=π/6×长径×(短径)2。计算肿瘤生长抑制率。肿瘤生长抑制率=(对照组平均瘤体质量-药物组平均瘤体质量)/对照组平均瘤体质量×100%。

1.4.4 用苏木精-伊红(HE)染色检测肿瘤组织的形态学

取移植瘤组织于4%多聚甲醛溶液中固定，经脱水、透明、透蜡处理后，进行石蜡包埋，制作石蜡切片，厚度5 μm，HE染色后封片，于显微镜下观察两组结肠癌组织变化或病理损伤情况。

2 统计学分析

3 结果

3.1 缺氧条件下两组裸鼠的一般情况

健脾消癌方组所有裸鼠在实验期间全部存活，第4周出现精神状态变差、食欲下降，进食进水和运动有所减少，皮毛不洁黯淡，少部对外界刺激反应性差；对照组5 只裸鼠在第21 天死亡，其余20 只实验期间全部存活，第3 周出现精神状态、食欲均不同程度地下降，进食进水和运动有所减少，皮毛不洁黯淡，大部对外界刺激反应性差。

3.2 缺氧条件下两组裸鼠体重变化情况

在缺氧条件下，两组裸鼠体重增长缓慢，实验结束时健脾消癌方组裸鼠平均体重为(32.5 ±0.6)g，对照组体重为(31.2 ± 0.7)g。实验结束时两组裸鼠体重差异无统计学意义(P = 0.089，P＞0.05)，见图1。

图1 缺氧条件下两组裸鼠体重的变化(±s，n=25)

3.3 缺氧条件下健脾消癌方对裸鼠瘤体体积的影响

两组裸鼠的移植瘤体积均随时间延长呈增长趋势，但与对照组相比，健脾消癌方组的移植瘤体积增长明显减缓，健脾消癌方干预21 d 后，健脾消癌方组移植瘤体积为(143.67±23.56)mm3，对照组(391.67±50.64)mm3，健脾消癌方组移植瘤体积小于对照组(P = 0.034，P＜0.05)；干预28 d后，健脾消癌方组移植瘤体积为(280.30 ± 37.89)mm3，对照组(561.4 ± 47.96)mm3，健脾消癌方组的移植瘤体积明显小于对照组(P = 0.009，P＜0.01)，两组比较差异有统计学意义，见图2。

3.4 缺氧条件下健脾消癌方对裸鼠瘤体质量及抑瘤率的影响

图2 缺氧条件下两组裸鼠瘤体体积的变化(±s，n=25)

健脾消癌方干预28 d 后，健脾消癌方组裸鼠平均瘤体质量明显低于对照组(P = 0.029，P＜0.05)，健脾消癌方组的抑瘤率为30.4%，见表1。

表1 两组裸鼠皮下移植瘤瘤体质量及抑制率比较(±s)

表1 两组裸鼠皮下移植瘤瘤体质量及抑制率比较(±s)

组别健脾消癌方组对照组瘤体质量(g)0.342±0.06 0.863±0.09抑瘤率(%)30.4-

3.5 HE染色观察健脾消癌方对裸鼠皮下移植瘤形态的影响

HE 染色光镜下可见对照组排列不规则，细胞膜不规则，细胞核异常增大裸露，可见多核性，核深染，密度增加，细胞质呈颗粒状具有空泡，一般具有高核质比(细胞核/细胞质)，形成结肠癌病理特征，如图3A 所示；健脾消癌方组与对照组相比细胞排列略规则，核深染及密集程度进一步减轻，如图3B所示。

图3 结肠癌组织病理改变的HE染色图（×100）

4 讨论

肿瘤微环境是指由肿瘤细胞及肿瘤周围的浸润免疫细胞、新生血管及内皮细胞、肿瘤相关成纤维细胞和细胞外基质共同构成的，其中包括炎症、低氧以及免疫抑制等方面。恶性肿瘤由于异常的血管形成、血管灌注减少以及肿瘤细胞无限制的生长都可导致微环境中氧含量降低，即缺氧微环境。肿瘤细胞在缺氧环境下可通过一系列的分子改变调整细胞代谢并适应缺氧环境并保持生长。缺氧环境在促进恶性肿瘤组织侵袭、转移过程中发挥着积极的作用[12-13]。因此，干预肿瘤缺氧微环境如改变细胞乏氧微环境和敲除乏氧通路关键基因——HIF-1α 等[14]，从而抑制肿瘤生长的治疗方法已成为当下研究热点。

《外科正宗》云：“蕴毒结于脏腑，火热流注肛门，结而为肿，其患痛连小腹，肛门坠重……肛门内蚀，串烂经络，污水流通大孔”。中医学认为，肠癌的发生是基于脏腑功能失调，并且受外界邪气的影响，导致气血阴阳失衡，湿、热、痰、瘀等诸多病理因素作用下引发恶性循环，形成了有利于肿瘤发生发展的微环境。中医药能通过多靶点效应调整机体的微环境，从而发挥遏制肿瘤生长、减缓转移等作用。

本研究模拟缺氧环境，通过建立结肠癌裸鼠皮下移植瘤模型，采用健脾消癌方进行干预，发现健脾消癌方可改善裸鼠体力状况，延长生存期，明显抑制结肠癌裸鼠肿瘤的生长，减轻结肠癌模型裸鼠的结肠病理损伤。总之，健脾消癌方对结肠癌缺氧微环境有积极影响，其充分发挥中医药的多靶点调节作用，能更好地指导结肠癌的实验研究和临床治疗。