谷胱甘肽的合成、代谢对早产儿脑损伤的影响

彭春媛，刘江勤

(1.同济大学附属第一妇婴保健院新生儿科，上海 201204；2.宁波市妇女儿童医院新生儿科，浙江 宁波 315012)

关键字:早产儿脑损伤；谷胱甘肽；核转录因子红系2相关因子2；抗氧化应激;抗氧化屏障

随着新生儿重症监护技术的不断发展，早产儿特别是极低出生体重儿的存活率大大提高。而早产儿脑损伤的发生也相应增多，作为影响早产儿远期神经系统发育的主要原因，其主要病因包括缺氧缺血、感染、低血糖、机械通气、高胆红素血症等[1]。造成早产儿脑损伤的机制包括兴奋毒性损伤和自由基损伤，其中自由基包括活性氧(超氧阴离子、羟基自由基、过氧化氢等)和活性氮(一氧化氮及其衍生物)。当自由基产生增加，抗氧化储备快速消耗，细胞蛋白、脂质和DNA被氧化，产生一系列生理、病理反应，即为氧化应激。早产儿对氧化应激特别敏感，常导致严重脑损伤。为抵抗氧化应激损伤，机体在不断进化中形成了一系列防御屏障。其中，谷胱甘肽在正常条件下能清除氧自由基，可与毒性代谢产物直接反应，或通过相关酶的作用将过氧化氢还原成水和氧，从而发挥抗氧化作用[2]。另外，谷胱甘肽也可作为一种金属结合蛋白，维持细胞内环境稳态和细胞正常代谢[3]。现就谷胱甘肽的合成、代谢对早产儿脑损伤的影响予以综述。

1 谷胱甘肽合成、代谢的主要相关酶

在谷胱甘肽的合成、代谢过程中，有几种关键酶参与了其中。细胞膜上的谷氨酸/胱氨酸转运体(glutamate/cystine transporter，xCT)将胱氨酸转运进入细胞，用于合成谷胱甘肽和含有半胱氨酸的蛋白。在细胞内，谷氨酸-半胱氨酸连接酶(glutamate cysteine ligase，GCL)摄取胱氨酸合成谷胱甘肽，维持细胞的抗氧化能力。谷胱甘肽过氧化物酶将谷胱甘肽氧化成为氧化型谷胱甘肽，同时谷胱甘肽在过氧化氢酶的作用下将过氧化氢还原成为水。而氧化型谷胱甘肽在依赖还原型辅酶/Ⅱ醌氧化还原酶1的作用下重新还原成为谷胱甘肽。谷胱甘肽的这个合成、代谢过程是机体重要的抗氧化屏障功能之一。

在谷胱甘肽的合成过程中，xCT的重要功能是将细胞外的胱氨酸转移进入细胞，用于合成谷胱甘肽，并将细胞内的谷氨酸转运出细胞外，实现神经递质信号转导。另外，xCT在神经细胞的发育过程中有重要作用，xCT部分失活的星形胶质细胞在体外培养时失去增殖能力。在体外培养的未成熟神经元和少突胶质细胞前体细胞表达的xCT水平明显低于成熟细胞，说明未成熟的神经细胞相较成熟神经细胞更易受到损伤[4]。xCT在神经细胞上的表达差异较大，研究显示小鼠神经细胞xCT的催化亚单位在神经元、少突胶质细胞和小胶质细胞上表达，但在星形胶质细胞上不表达，若抑制xCT的表达会导致谷胱甘肽耗竭，神经元退行性变和脱髓鞘，细胞稳态被破坏[5]。另有研究发现，小鼠xCT主要在星形胶质细胞上表达，在神经元不表达，通过上调细胞膜上的xCT表达能促进星形胶质细胞摄取胱氨酸，可提高谷胱甘肽的产量，从而使周围神经细胞具有抗氧化应激能力[6]。砷处理的小胶质细胞通过竞争性抑制xCT引起细胞外胱氨酸/谷氨酸不平衡，即培养液中的胱氨酸含量减少，谷氨酸含量增加，从而导致周围不成熟神经元细胞死亡，补充N-乙酰半胱氨酸能改善神经元存活率[7]。以上证据表明，xCT在细胞的增殖、维持稳态及促进神经细胞保护方面有重要作用。

GCL是谷胱甘肽合成的限速酶，由催化亚基和调节亚基组成，通过该酶摄取胱氨酸合成谷胱甘肽，维持细胞抗氧化能力，可实现神经保护作用[8]。谷胱甘肽的合成由多种因素控制，包括GCL的水平、两个亚基的比例、合成谷胱甘肽的底物L-胱氨酸和细胞内谷胱甘肽水平的负反馈对GCL的抑制[9]。动物实验发现，通过抑制大鼠GCL基因表达可导致线粒体内谷胱甘肽稳态受损，线粒体功能障碍，神经细胞减少[10]。神经细胞缺乏GCL会导致谷胱甘肽产量显著降低，进而增加细胞对缺氧损伤的敏感性[11]。Pehar等[12]研究发现，敲除小鼠星形胶质细胞的GCL调节亚基，其总谷胱甘肽水平降低80%，从而使得对神经元的保护作用减弱。也有研究显示，当GCL的活性持续下降时，谷胱甘肽水平也持续降低，但氧化性DNA损伤水平较高；GCL过度表达可显著提高谷胱甘肽水平，抑制DNA氧化损伤，从而抑制肿瘤细胞的迁移和生长[13]。GCL的基因存在多态性，并影响其转录和表达水平，特别是当细胞处于氧化应激时，这种基因的多态性会改变细胞内谷胱甘肽的稳态，最终导致细胞容易受到氧化应激损伤。因此，实验室常用谷胱甘肽抑制剂抑制GCL的作用，从而减少谷胱甘肽合成，且谷胱甘肽缺乏的动物模型也常采用GCL基因敲除制作。另外，GCL在细胞发育成熟过程中也起关键作用，敲除GCL基因的小鼠胚胎不能发育成熟，细胞发生大量凋亡，但在培养基中加入谷胱甘肽或N-乙酰半胱氨酸可促进胚球的发育。

2 核转录因子红系2相关因子对抗氧化应激的调控作用

核转录因子红系2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)为碱性亮氨酸锌基转录因子，其是外源性有毒物质和氧化应激的感受器，也是细胞抗氧化反应的中枢调节者。它介导启动下游编码抗氧化蛋白和解毒酶对抗氧化应激的损害，这是一个重要的细胞防御机制。正常生理状态下，Nrf2在细胞质内与抑制它的Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1结合，使Nrf2成为 E3泛素连接酶的适配底物，促进Nrf2泛素化继而被26S蛋白酶体降解。当自由基、毒性物质增多时，亲电子物质对Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1的半胱氨酸残基进行修饰，引起 Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1的构象变化，进而导致Nrf2与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1解离，此时Nrf2稳定性增加并转入细胞核中与抗氧化特异基因启动子区域的抗氧化反应元件结合，启动解毒酶和抗氧化基因表达，这是Nrf2最普遍的活化方式，这一激活过程称为Nrf2-抗氧化反应元件通路；另外，Nrf2还可以通过促分裂原活化的蛋白激酶、蛋白激酶C和磷脂酰肌醇-3-激酶等途径磷酸化而间接激活。Nrf2调节许多细胞保护蛋白的表达，如xCT、GCL、血红素氧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、依赖还原型辅酶/Ⅱ醌氧化还原酶1，这些酶参与调节谷胱甘肽的合成、代谢，有效阻断由于谷胱甘肽缺乏、谷胱甘肽利用障碍等原因引起的神经毒性作用，从而保护机体免受活性物质及一些有毒物质的侵害[14]。一项模拟脑缺血缺氧/复氧损伤的动物实验显示，抑制Nrf2降解，增强其与抗氧化反应元件结合的活性，有利于大脑神经细胞缺血再灌注损伤后恢复[15]。在氧化应激损伤时，作为Nrf2的激活剂特丁基对苯二酚通过提高谷胱甘肽水平、增加Nrf2的稳定性及抑制Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1泛素化发挥其抗氧化功能，从而减轻神经细胞凋亡[16-17]。此外，有研究发现钙上调谷胱甘肽水平起神经保护作用就是通过Nrf-2介导实现，而敲除Nrf2基因这种保护作用将消除[18]。临床上，激活Nrf2的药物二甲酸富马酸也是通过增加Nrf2的活性而具有间接延缓神经元死亡的作用[19]。且Nrf2及其激活剂还可通过调节xCT的基因表达，具有神经保护作用[20]。但缺乏xCT是否会减弱Nrf2诱导的神经保护作用，尚需进一步研究。

研究发现，微RNA(microRNA，miRNA)与Nrf2、抗氧化蛋白酶之间有密切联系[21-22]。miRNA是一类存在于动植物体内、大小为21～25nt的内源性非编码单链小分子RNA。在动物细胞中，大多数miRNA通过与靶基因的信使RNA 3′非翻译区结合阻止转录后的翻译，从而起到调节基因表达的作用。在一个miR-144过表达模型中，miR-144不仅使神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞内氧自由基增加，细胞活性降低，谷胱甘肽和抗氧化酶活性降低，也使GCL催化亚基、GCL调节亚基、Nrf2表达减少[21]。有学者采用实时定量聚合酶链反应分析发现，心肌梗死后左心室细胞内的miR-27a、miR-28-3p和miR-34a表达水平高于其他器官，这些miRNA通过抑制Nrf2活性增加氧化应激，从而导致心力衰竭[22]。以上研究说明，miRNA可以通过对Nrf2的负性调节使细胞抗氧化能力降低。也有研究者通过建立小鼠顺铂诱导的急性肾损害模型发现，miR140-5p直接作用于Nrf2的3′非翻译区并起着积极调节Nrf2表达的作用，且依赖还原型辅酶/Ⅱ醌氧化还原酶1、血红素氧化酶的水平也明显提高，因而细胞的抗氧化能力显著增强[23]。可见，对miRNA调节氧化应激的深入研究，很可能为将来治疗感染、肿瘤和自身免疫系统疾病提供一种全新的治疗手段。

3 星形胶质细胞在抗氧化屏障中的作用

星形胶质细胞在抗氧化应激过程中有非常重要的作用，其功能受损是神经元及其他神经细胞原发性和继发性受损的重要原因[24]。星形胶质细胞是人类大脑内数量最多的细胞，不同程度的神经损伤会激活星形胶质细胞，改变其形态及功能蛋白的表达，对周围神经细胞产生影响，形成胶质瘢痕。在神经损伤的早期阶段，激活的星形胶质细胞通过多种方式促进神经元的存活，但随着损伤的进展，它又会抑制神经元的再生。

星形胶质细胞在神经损伤中的一个重要保护机制为其通过合成谷胱甘肽，清除损伤产生的毒性产物(氧自由基、铁和氧化的脂质等)，从而抑制氧化应激损伤[2]。这一解毒过程需要星形胶质细胞内有足够水平的谷胱甘肽，不同解毒过程在一定条件下相互干扰甚至相互竞争谷胱甘肽；星形胶质细胞中谷胱甘肽的合成、循环、输出受损可能影响谷胱甘肽依赖的解毒过程，进而对星形胶质细胞产生损害，同时对其他脑细胞的抗氧化保护作用也减弱[25]。研究表明，当神经元与星形胶质细胞共培养时，其谷胱甘肽在12和24 h分别增加1.5倍和5倍，可阻断鱼藤酮和百草枯引起的胎鼠大脑皮质神经元死亡和损伤[26]。此外，共培养的星形胶质细胞还可通过食欲肽-A受体1/蛋白激酶Cα/胞外信号调节激酶1/2/谷氨酸转运体途径提高谷胱甘肽水平，增强抵抗缺氧低糖损伤的能力[27]。另有研究表明，磷酸腺苷激活的蛋白激酶能选择性调节星形胶质细胞内GCL调节亚基的表达，促进谷胱甘肽合成，从而保护神经元[8]。且星形胶质细胞对新生儿的脑保护作用，还表现在它对谷氨酸的摄取，减轻谷氨酸对新生儿脑兴奋性的毒性作用；在丙酮酸羧化酶的作用下，星形胶质细胞能够合成神经递质，促进神经元的正常发育[28]。可见，星形胶质细胞是大脑合成谷胱甘肽的主要细胞，它对周围脑细胞起重要的保护作用。但目前对未成熟星形胶质细胞Nrf-2调节谷胱甘肽合成、代谢过程及其对损伤的反应和神经保护机制的研究相对较少，需进一步探索。

4 谷胱甘肽水平对早产儿大脑的影响

早产儿大脑的谷胱甘肽水平是否与足月儿或成人大脑有差别，目前尚没有明确的结论。一项较大样本的尸检显示，新生儿大脑的谷胱甘肽水平与老年人相似，但成年人的谷胱甘肽水平较高，推测原因为成年人接受较多的氧化应激，从而维持较高水平的谷胱甘肽[29]。一项研究通过监测不同孕周母血和出生时脐血中的氧化产物、谷胱甘肽过氧化物酶等发现，氧化酶和抗氧化酶呈负相关，故推断谷胱甘肽参与的抗氧化系统保证了妊娠的维持[30]。在早产和受损的新生大鼠大脑中谷胱甘肽水平低于正常足月大鼠，且细胞凋亡也更严重[31]。这可能由于谷胱甘肽的代谢受多个代谢酶的影响，这些代谢酶水平低下，导致谷胱甘肽的合成功能不成熟，且在受到氧化应激时维持还原状态的能力也有限。因此，当大脑皮质遭受缺氧损伤时，谷胱甘肽的储备显著减少，脑组织内氧化型谷胱甘肽、脂质过氧化物水平升高，而给予新生猪N-乙酰半胱氨酸(谷胱甘肽合成前体)可显著降低新生猪大脑皮质的炎症介质白细胞介素-1β及核因子κB水平，恢复组织谷胱甘肽储备，起神经保护作用[32]。以上研究表明，相较于成熟个体，早产个体大脑对谷胱甘肽的合成、代谢、利用能力较弱，而通过提高谷胱甘肽合成代谢相关酶活性或提供N-乙酰半胱氨酸可改善谷胱甘肽在抗氧化应激中的作用。

5 小 结

目前，许多国内外学者致力于研究早产儿脑损伤的发生发展机制、预防治疗措施，以期改善脑损伤早产儿的远期预后。但越来越多的证据表明，早产儿大脑合成和调节谷胱甘肽的抗氧化屏障还不成熟，这可能是早产儿易发生脑损伤一个重要机制[7，33-34]。而Nrf-2介导的谷胱甘肽参与的抗氧化屏障对各种外来和内在的应激起重要的保护作用；星形胶质细胞作为脑内数量最多的细胞，它在脑细胞保护方面也起关键作用。相信随着对谷胱甘肽合成、代谢过程的深入研究，其将对早产儿脑损伤的防治工作产生深远影响。