复方芪芎颗粒对佐剂性关节炎大鼠的抗炎作用*

陈利锋，杨晨曦，王华松，卢绮萍，夏莹，董望梅

(1.中国人民解放军中部战区总医院中西医结合科，武汉 430070；2.湖北中医药大学研究生处，武汉 430061；3.中国人民解放军中部战区总医院骨科，武汉 430070；4.中国人民解放军中部战区总医院普通外科，武汉 430070； 5.湖北省中医院心电图室，武汉 430061；6.武汉市蔡甸区大集街卫生院，武汉 430113)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以滑膜炎为特点的自身免疫性疾病，严重时可引起关节软骨和骨的破坏，最终导致关节畸形及功能障碍[1]。RA的病程越长，病患残疾率越高。根据曾小峰等[2]调查，我国RA患者在患病前5年致残率为18.6%，病程每增加5年，致残率分别上升为43.5%，48.1%，61.3%。此外，RA并发的其他基础疾病，使得RA患者与一般人群相比有着更高的病死率[3]。RA的高致残率及并发症给患者带来极大的心理压力，也给社会带来巨大的经济负担。临床上治疗RA主要依靠非甾体类抗炎药、抗风湿药物及糖皮质激素等[4]，但常因药物的不良反应、价格等因素，难以坚持长期服药。近年来，中医药的治疗作用在临床上越来越受重视，白芍总苷、青藤碱等中草药提取物治疗RA的出现，给中医药治疗RA带来新思路[5]。

古代医书中的“尪痹”“痹证”即为RA，古人认为痹症多因自身正气不足，再加外感风寒湿邪而致病，故治宜“祛邪活络，缓急止痛”。复方芪芎颗粒是由“补阳还五汤”化裁而成，具有“活血通络，行气止痛”之功效。前期实验结果表明其可显著改善佐剂性关节炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠的关节炎症状，其机制可能是与下调白细胞介素15(interleukin 15，IL-15)、白细胞介素33(interleukin 33，IL-33)等表达有关[6]。笔者在本研究新增检测Toll样受体2(Toll-like receptor 2，TLR2)、髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)蛋白与TLR2 mRNA，进一步阐明复方芪芎颗粒对于RA大鼠滑膜炎的治疗机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 健康无特定病原体(SPF)级雄性Wistar大鼠60只，月龄2～3个月，体质量200～220 g，由湖北省实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCKK(鄂)2008-0005。分组前先行适应性喂养1周。

1.1.2实验药物 制备复方芪芎颗粒：黄芪、川芎各40 g，牛膝、红花、桃仁、当归、益母草各15 g，独活、秦艽、羌活、荆芥、小罗伞、六棱菊、香附各10 g，药物由中国人民解放军中部战区总医院中药房提供，刘辉副教授进行中药鉴定。将药材以适量纯化水煎煮两次，将两次收集到的药液均匀混合，高温浓缩后烘干，捣碎成中药粉末(每克粉末相当于生药4.64 g)。雷公藤多苷片(黄石飞云制药有限公司，批号：20150901)。

1.1.3试药 异硫氰酸胍(Aidlab公司，批号：252250AX)；完全弗氏佐剂(CFA，Sigma-Aldrich公司，批号：F-5881)；逆转录酶(M-MLV Reverse Transcriptase，GeneCopoeia公司，批号：CO2010A)、缓冲液(RT Reaction Buffer，GeneCopoeia公司，批号：CO2010A)；dNTP 混 合 物 (dNTP Mixture，Tingen公司，批号：LOTb M1123)；核糖核酸酶抑制因子(RNase Inhibitor，TransGen公司，批号：LOTbI2122)；All-in-one tm qPCR Mix(Vazyme公司，批号：Cat#D01010A)；耐热型DNA聚合酶(Takara公司，批号：D502A)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，批号：P0010)；苯甲基磺酰氟化物(PMSF，上海碧云天生物技术有限公司，批号：ST506)、蛋白marker(北京全氏金生物技术有限公司，批号：IPVH00010)；RIPA 裂解液(上海碧云天生物技术有限公司，批号：P0013B)；BSA标准品(上海碧云天生物技术有限公司，批号：P0010)；兔抗TLR2(Abcam公司，批号：ab13867)、HRP标记羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司，批号：BA1054)；兔抗GAPDH(杭州贤至生物有限公司，批号：AB-P-R 001)；电致化学发光(electrochemiluminescence，ECL)底物液(Thermo公司，批号：NCI5079)。

1.1.4仪器 X线胶片(柯达公司，批号：XBT-1)；显影定影试剂盒(武汉巴菲尔生物技术服务公司)；游标卡尺(山东仪器厂)；7900/Viia7型实时荧光定量PCR仪(Illumina公司)；752型分光光度计(上海舜宇恒科学仪器有限公司)；JY02S型紫外分析仪(北京君意东方电泳设备有限公司)；DYCZ-40型电转仪(北京六一仪器厂)；muLISKANMK3型酶标仪(Thermo公司)；HI650型离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)。

1.2方法

1.2.1分组与造模 将60只大鼠适应性喂养1周后，分别称定质量、做标记，以体质量为分层因素随机均分为空白对照组，模型对照组，复方芪芎颗粒小剂量组，复方芪芎颗粒中剂量组，复方芪芎颗粒大剂量组，雷公藤多苷组。按常规制备方法制备佐剂性关节炎大鼠模型[7]。造模大鼠在其右后足垫皮下注射CFA 20 μL，空白对照组于相同位置注射0.9%氯化钠溶液20 μL，在第3天，第7天再次注射。

1.2.2给药 造模2周后，开始持续灌胃给药3周，用药剂量参照成人临床用药剂量，以体表面积法换算为大鼠等效剂量[8]。空白对照组和模型对照组每日予以纯化水10 mL·kg-1，灌胃1次；复方芪芎颗粒小、中、大剂量组：将药物粉末充分溶于纯化水后，分别予0.01，0.02，0.03 g·mL-1复方芪芎颗粒液10 mL·kg-1，每日一次；雷公藤多苷组：予以0.94 mg·kg-1雷公藤多苷片溶液10 mL·kg-1。

1.2.3主要观察指标 定期观察大鼠右后足跖肿胀度，并于造模后2周、给药后1周及给药后3周，测量记录各组大鼠右后肢足跖厚度。测量方法：限制大鼠活动后，将大鼠右后肢拉直，用记号笔在大鼠足跖中后1/3处测量处作标记，以0～150 mm游标卡尺测量。

1.2.4大鼠滑膜组织TLR2及MyD88蛋白的测定 在麻醉状态下处死大鼠后，以膝关节为中心逐层切开分离，剥离可得髌骨下方一层呈淡黄色的组织，即为滑膜组织。蛋白印迹法(Western blotting)检测TLR2和MyD88蛋白表达水平：将裂解液(含PMSF)400 μL加入到滑膜组织中，将裂解液4 ℃下 12000 r·min-1离心5 min，取上清液，分装，置于-20 ℃条件下保存。将蛋白样品、BSA标准品稀释后加入96孔板内，标准品各设2个平行孔，待测样品设3个平行孔，每孔加入体积为20 μL。将BCA试剂盒中A液和B液进行混合，加入96孔板内，每孔加入200 μL。用酶标仪测定波长568 nm吸光度值(A值)。根据标准蛋白浓度和A值计算出直线回归方程，代入蛋白样品A值，利用回归方程计算样品蛋白浓度。

将保存的上清液与缓冲液放入沸水中制备电泳胶，再将电泳胶固定到电泳槽上进行恒压电泳。取出凝胶切下目的条带，冲洗后进行转膜。将ECL试剂中增强液与稳定的过氧化物酶溶液混匀，滴于聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，反应数分钟后，吸去多余的底物液，覆上保鲜膜，X光胶片压片，依次显影、定影。冲洗晾干胶片后，扫描胶片，用BandScan分析胶片灰度值。

1.2.5大鼠滑膜组织TLR2 mRNA表达水平的测定 先取大鼠滑膜组织，用Trizol法提取总RNA，再按步骤行TLR2 mRNA表达水平检测。第一步逆转录成cDNA，逆转录反应体系：RNA 3.96 μg、Oligo (dT) 15 (10 μmol·L-1) 2 μL、dNTP (2.5 mmol·L-1) 2 μL、ddH2O (Rnase free)加至14.5 μL，反应条件：70 ℃ 5 min，短暂离心后置于冰上。再加入反应物：第一次反应体系中的PCR管全部14.5 μL、5×RT buffer 4 μL、RNase Inhibitor 0.5 μL、M-MLV reverse transcriptase 1 μL、ddH2O (RNase free)加至20 μL，反应条件：42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min。第二步行半定量RT-PCR检测，反应体系：rat-actin F (10 μmol·L-1) 0.5 μL、dNTP (2.5 mmol·L-1) 2 μL、Ex Taq 0.25 μL、10×Ex Taq E buffer 2.5 μL、cDNA 1 μL、ddH2O加至25 μL，反应条件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s，30个循环；72 ℃ 4 min，4 ℃ 4 min。最后进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，PCR反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。最后行溶解曲线，最终数据以2-△△Ct进行分析。TLR2及GAPDH PCR引物序列见表1。

表1 TLR2及GAPDH PCR引物序列及产物大小

Tab.1PCRprimersequencesandproductsizesofTLR2andGAPDH

基因名称PCR引物序列上游引物下游引物产物大小/bpGAPDHACAGCAACAGGGTGGGTGGACTTTGAFFFTGCAGCGAACTT252TLR2TTATCCAGAGCCGTTGGTGCCCACTCGAGGTAGGTGTT171

2 结果

2.1关节炎大鼠造模成功且模型稳定 造模2周后，各造模组大鼠足跖厚度数值均大于空白对照组(均P<0.05)。模型对照组大鼠在造模2周后、给药1周、给药2周，足跖厚度数值稍有变化，但差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2大鼠足跖厚度的比较 结果见表2。给药3周后，模型对照组大鼠足跖厚度较空白对照组明显上升(P<0.05)，而给予复方芪芎颗粒灌胃治疗的大鼠，足跖厚度小于模型对照组(P<0.05)。复方芪芎颗粒大、中剂量组大鼠足跖厚度均小于小剂量组及雷公藤多苷组(P<0.05)。

表2 6组大鼠足跖厚度比较

组别造模后2周给药1周后给药3周后空白对照组0.43±0.330.46±0.040.45±0.56模型对照组0.91±0.24∗10.90±0.410.93±0.03雷公藤多苷组0.92±0.23∗10.79±0.040.71±0.03∗2复方芪芎颗粒 小剂量组0.93±0.08∗10.81±0.050.73±0.07∗2 中剂量组0.89±0.34∗10.77±0.05 0.51±0.15∗2∗3∗4 大剂量组0.91±0.03∗10.74±0.17 0.50±0.83∗2∗3∗4

与空白对照组比较，*1P<0.05；与模型对照组比较，*2P<0.05；与复方芪芎颗粒小剂量组比较，*3P<0.05；与雷公藤多苷组比较，*4P<0.05。

Compared with blank control group,*1P<0.05;Compared with model control group,*2P<0.05;Compared with low-dose compoundQixionggranule group,*3P<0.05;Compared with tripterygium glycosides group,*4P<0.05.

2.3各组大鼠关节滑膜组织中TLR2、MyD88蛋白表达水平 各造模组大鼠滑膜组织TLR2、MyD88蛋白表达水平明显高于空白对照组(P<0.05)。各给药组TLR2、MyD88表达水平低于模型对照组(P<0.05)。与雷公藤多苷组比较，复方芪芎颗粒中、大剂量组TLR2、MyD88的蛋白表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1，表3。

A.空白对照组；B.模型对照组；C.复方芪芎颗粒小剂量组；D.复方芪芎颗粒中剂量组；E.复方芪芎颗粒大剂量组；F.雷公藤多苷组。

图1 6组大鼠关节滑膜组织中TLR2、MyD88蛋白表达水平

A.blank control group; B.model control group; C.low-dose compoundQixionggranule group; D.medium-dose compoundQixionggranule group; E.high-dose compoundQixionggranule group; F.Tripterygium glycosides group.

Fig.1ProteinexpressionlevelsofTLR2andMyD88insynovialtissuesofsixgroupsofrats

表3 6组大鼠关节滑膜组织中TLR2和MyD88蛋白表达水平比较

组别TLR2MyD88空白对照组1.03±0.011.12±0.11模型对照组3.85±0.08∗14.12±0.42∗1雷公藤多苷组2.53±0.03∗22.87±0.22∗2复方芪芎颗粒 小剂量组2.78±0.06∗22.98±0.31∗2 中剂量组1.73±0.11∗2∗31.91±0.34∗2∗3 大剂量组1.63±0.41∗2∗31.78±0.24∗2∗3

与空白对照组比较，*1P<0.05；与模型对照组比较，*2P<0.05；与雷公藤多苷组比较，*3P<0.05。

Compared with blank control group,*1P<0.05;Compared with model control group,*2P<0.05;Compared with Tripterygium glycosides group,*3P<0.05.

2.4大鼠滑膜组织中TLR mRNA的表达水平 给药组TLR2 mRNA的表达水平明显低于模型对照组(P<0.05)。雷公藤多苷组TLR2 mRNA的表达水平高于复方芪芎颗粒大、中剂量组(P<0.05)，与蛋白表达情况相似。见表4。

表4 6组大鼠TLR2 mRNA的表达情况

组别TLR2 mRNA空白对照组0.92±0.11模型对照组2.32±0.24∗1雷公藤多苷组2.08±0.31组别TLR2 mRNA复方芪芎颗粒 小剂量组2.11±0.30 中剂量组1.42±0.23∗2 大剂量组1.29±0.08∗2

与空白对照组比较，*1P<0.05；与雷公藤多苷组比较，*2P<0.05。

Compared with blank control group，*1P<0.05；Compared with Tripterygium glycosides group，*1P<0.05.

3 讨论

RA的发病机制至今仍不明确，其基本病理变化为小关节持续性滑膜炎，逐渐演变造成关节软骨侵蚀和骨破坏[9]，最终导致肢体功能障碍。炎症信号通路的研究一直是该疾病的热点研究方向[10]，其中TLR/MyD88信号转导通路是人体先天性免疫最重要的信号通路之一，此通路的过度表达被认为在RA病程进展中影响较大[11]。

SABER等[12]通过研究小鼠关节炎模型发现，在炎症起始阶段TLR2活化后促进血管的发生，便于炎症细胞黏附与侵袭，导致关节软骨与骨破坏。HUANG等[13]发现RA关节腔滑液中巨噬细胞与正常巨噬细胞相比，高表达TLR2。而MyD88是一种胞质可溶性蛋白，负责承接上游 TLRs 活化信号和募集下游的含有死亡区域(death domain，DD)的信号分子[14]，最终导致炎症因子的释放。PARK等[15]发现阻断MyD88可改善RA患者临床症状和炎性指标，也说明MyD88在TLR和细胞炎性因子之间的桥梁作用。本课题组前期研究[16]发现TLR2在RA模型大鼠滑膜组织中高度表达，经复方芪芎颗粒干预后，大鼠的关节炎症状明显减轻，且TLR2蛋白的表达也受到明显抑制，也说明TLR2蛋白过度表达在RA的病程进展中起到重要作用。

针对RA的新药开发一直是国内外研究热点，近年来国外医药公司不断推出新的生物制剂[17]，国内学者亦致力于中药复方的开发。敬博[18]应用独活寄生汤治疗RA患者，可明显缩短患者患肢晨僵时间、减轻关节疼痛。杨俏雯等[19]研究发现患者服用黄芪桂枝五物汤，其关节炎症状及实验室指标均优于口服来氟米特片。

复方芪芎颗粒以经典的临床有效方剂补阳还五汤[20]为基础，在原方基础上增加具有祛湿止痛功效的中药，如独活、秦艽等。前期实验研究[6，21]表明其可通过下调IL-8、IL-15、IL-33、核因子κB(nuclear factor-kappa-B，NF-κB)等细胞因子起到抑制RA进程的作用，此次实验结果则提示其具体机制可能是通过抑制TLR2/MyD88途径，从而达到调控下游各细胞因子的作用。本次实验发现中、大剂量复方芪芎颗粒对改善RA大鼠的足跖肿胀程度作用明显，能明显抑制大鼠关节滑膜组织TLR2、MyD88蛋白及TLR2 mRNA的表达，其可能的机制为抑制滑膜组织中TLR2/MyD88信号通路。