无患子果皮皂苷提取工艺研究

陈莎莎，陈丽萍，林继辉

(闽南科技学院 生命科学与化学学院，福建 南安 362332)

无患子皂苷是无患子果皮重要的组成成分之一[1]，其主要包括齐墩果烷型皂苷、达玛烷型皂苷、三萜类皂苷3种皂苷[2-3].其中皂苷总量约占总的质量的 4%[4].无患子果皮中富含大量的皂苷及苷元，是一款良好的天然非离子型表面活性剂[5]；对土壤重金属具有良好的淋洗去除促进作用[6]，并且分解效果甚佳，最重要的是无残留有害物质，对皮肤的敏感性小，是护肤品、洗发香波等各类生物洗涤剂的优质原料[7].

目前，无患子皂苷存在良好的市场前景：无患子在中国台湾、日本、美国早有研究并使用到日常生活和医疗上[8]；国内涉及无患子皂苷的提取以及提纯研究处于前期阶段，科究工作尚未深入；从绿色环保这面来看，无患子皂苷是一种天然的表面活性剂，能够被百分百的分解[9]，对环境无污染，适应于各种极限条件[10-11].无患子皂苷作为性能良好的天然表面活性剂，在生态环境的保护方面显然优于市面上其他洗涤剂，并且有很好的经济效益和社会效益[9].

本文章采用索氏提取法，以丙酮为提取剂，分别对丙酮浓度，固液比，提取时间，温度等多方面因素进行探究，通过正交实验来确定其最佳提取工艺条件,为日后无患子皂苷提取、提纯及应用等方面的深层研究提供相应参考，促进无患子皂苷产业发展.

1 试验部分

1.1 试验主要仪器及材料

试验材料：香草醛(鱼台县海纳环保科技有限公司)，硫酸(西陇化工股份有限公司)，甲醇(天津市福晨化学试剂厂)，正丁醇(天津市福晨化学试剂厂)，冰醋酸(西陇化工股份有限公司)，丙酮(衡阳市凯信化工试剂有限公司)，齐墩果酸(上海金穗生物科技有限公司)，以上试剂均为分析纯；无患子(市售).

仪器设备：集热式恒温加热磁力搅拌器(DF-101S,郑州长城科工贸有限公司)，循环水式多用真空泵(SHB-Ⅲ，郑州长城科工贸有限公司)，鼓风干燥箱(DGX-9053B，上海精宏实验设备有限公司)，真空干燥箱(DZF-6021，上海精宏实验设备有限公司)，超声波清洗器(KQ5200E，昆山市超声仪器有限公司)，可见风光光度计(721W，尤尼柯 上海仪器有限公司)，高速多功能粉碎机(JP-150A，永康市久品工贸有限公司)，旋转蒸发仪(IKA RV8 HB10，上海圣科仪器设备有限公司)，电子天平(JJ600，常熟市双杰测试仪器厂)，电子天平(EL104，厦门东鹏实业有限公司 梅特勒).

2 试验方法

2.1 工艺流程

2.2 无患子皂苷的提取

称一定量的无患子果皮置于干燥箱中，80 ℃烘干，用粉碎机粉碎过0.301 mm 筛.准确称取无患子果皮粉末 30 g，加入约 300 mL的蒸馏水浸泡，每隔 3 h 换1次水，重复4次[12]，后用无纺布过滤，再把滤渣装进无纺布袋子中备用.以75%的丙酮为提取液，75 ℃的水浴对滤渣进行提取，获得无患子皂苷粗提液.将无患子皂苷粗提液转移到旋转蒸发仪蒸馏瓶中，温度 45 ℃，转速 40 min，除去丙酮，得到粘稠状粗提物.以水饱和正丁醇溶液作为萃取剂，依次取 20、10、10 mL萃取剂对粗提物进行萃取，后合并萃取液[13].分层后保留上层溶液，该层为正丁醇层，含无患子皂苷，再利用旋转蒸发仪除去正丁醇[14]，再将剩下的少量液体液体转移到蒸发皿，70 ℃真空干燥至恒重，得样品无患子果皮皂苷粉末，后取出称重并记录数据，最后保鲜袋密封并置于干燥器中保存备用.

2.3 无患子果皮提取物皂苷得率测定

采用齐墩果酸法测定无患子果皮中的皂苷含量[15]，分别称取6.25 mg干燥的齐墩果酸粉末标准品[16]和样品粉末，用甲醇溶解，待完全溶解后转移至25 mL容量瓶中，定容，摇匀后即获得齐墩果酸标准品溶液及无患子果皮皂苷样品溶液.

2.3.1 检测波长的确定

通风环境下，移取齐墩果酸标准品溶液以及无患子果皮皂苷样品溶液各 0.5 mL，分别装入比色管中，70 ℃水浴蒸干甲醇，白色粉末残留比色管内壁，依次加入5%香草醛-冰醋酸溶液3 mL、60%H2SO4溶液4.5 mL，充分震荡，60 ℃恒温水浴中加热 15 min，取出，冷却，再静置 15 min.以蒸馏水为空白对照，用分光光度计在420～800 nm的范围内测两者最大吸收波长,确定 520 nm为样品总皂苷的测定波长[17].

2.3.2 标准曲线

取8支比色管，分别加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL 0.25 mg/mL齐墩果酸标准品溶液，并标号1～8，用 70 ℃水浴蒸干甲醇后，各加入 3 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液、4.5 L 60% H2SO4溶液，充分震荡，60 ℃恒温水浴中加热 15 min，冷却，静置 15 min.以空白溶液为参比，于 520 nm波长处测定各组样品的吸光度.以测得结果的吸光度为纵坐标和对应质量的浓度为横坐标绘制标准曲线，请见图1.结果显示：Y=0.6166X-0.0606(R2=0.993 3)，齐墩果酸在质量浓度为0.125 1 mg/mL范围内，浓度与吸光度呈良好的线性关系.

2.3.3 无患子果皮提取物中的皂苷得率测定

准确移取 1 mL的无患子果皮皂苷样品溶液于比色管中，用2.3.2处理齐墩果酸标准品方法处理无患子果皮皂苷样品溶液，并测其吸光度，最后计算无患子果皮中皂苷的得率.

2.4 单因素试验设计

通过初期的预实验探索，选取丙酮溶液浓度、提取时间、提取温度、固液比作为单因素考察对象，以无患子皂苷提取率为指标，在初始条件下，考察不同丙酮浓度(65%、70%、75%、80%、85%、90%)，不同提取时间(30、60、90、120、150、180 min)、不同提取温度(65、70、75、80、85、90 ℃)、不同固液比(3∶7、3∶8、3∶9、3∶10、3∶11、3∶12)对无患子果皮皂苷的影响.

3 试验结果及分析

3.1 丙酮溶液体积分数对无患子果皮皂苷得率的影响

当其他条件不变，考察丙酮溶液体积分数对无患子果皮皂苷得率的影响.由图2可以看到体积分数在65%～80%之间得率呈上升趋势，而后体积分数升高得率又略微下降.这是因为80%的含水量少，经过反复虹吸回流的过程充分分离了糖类和脂肪类物质，所以在分离丙酮和初提物时效果明显，提取得到的纯度也是较高的.当65%、70%的丙酮溶液作为提取剂，蒸发丙酮和正丁醇时产泡强烈[16]，不能彻底蒸发丙酮和水还有正丁醇，影响提取效果.固然有获得提取粉末，然而结果不够准确，试验中难控制，所以不作为提取剂的试验研究[8].丙酮溶液体积分数不能太小，体积分数小的丙酮含水量高，旋转蒸发皂苷时较易产泡，导致效果不好.当体积分数达到85%以上时，由于旋转蒸发过程中没办法把残留在瓶壁上的提取物取出，浪费较多，影响数据结果.

3.2 提取时间对无患子果皮皂苷得率的影响

在其他条件不变时，研究提取时间对于无患子果皮皂苷得率的影响.如图3所示实验结果，随着时间加长，原料中的成分逐渐分散到溶剂中，皂苷得率随之增高.在 120 min 时皂苷得率不再上升，溶于溶剂中的成分达到一定浓度，溶解速度降低.时间持续增长得率反而逐渐减小，这可能是部分皂苷发生水解，生成副产物，影响提取物纯度和之后利用.同时提取时间越长会增添耗能[18].

3.3 提取温度对无患子果皮皂苷得率的影响

当其他条件不变时，研究提取温度对无患子果皮皂苷得率的影响.由图4可以明显看出，在 75 ℃以下，提取温度达不到丙酮溶液的沸点，没办法完全提取出无患子皂苷，跟着温度高升，得率提高，温度上升不光影响皂苷在提取剂中的溶解度，并且降低提取剂的黏度，增大扩散系数，加快传质[2]，使无患子果皮皂苷提取得率有所提高；然而大于 80 ℃时无患子果皮皂苷提取得率反而有所下降，这可能是温度过高致使一些皂苷水解，生成副产物，而且增添耗能[12].

3.4 料液比对无患子果皮皂苷得率的影响

在其他条件不变时，考察料液比对无患子果皮皂苷得率的影响.如上图5实验结果可知，随着提取溶液加入量的增多，活性物质充分溶解到提取液中，无患子皂苷得率也随之增加.当料液比为 3∶10时达到相对高的得率，与料液比为 3∶11、3∶12的无患子果皮皂苷得率相差不多，接近平衡.这主要原因是随着料液比的增大，由于存在渗透压，活性物质逐渐从细胞内部溶出并通过扩散作用到溶液中，当溶液中的活性物质达到跟细胞内部活性物相等时扩散作用停止，此时溶液浓度不变.料液比大时虽然能较完全提取皂苷，但增加提取成本，影响经济效益.在料液比过低时，由于提取溶液不足以充满整管，活性物质不能较完全溶解[14]，提取皂苷不彻底，影响得率.

3.5 正交实验设计和结果分析

3.5.1正交实验设计方案

在单因素实验分析的基础上进行正交实验设计，通过对丙酮体积分数A、提取时间B、提取温度C、固液比D 4因素设计L9(34)正交实验方案.

表1 正交实验因素水平表

3.5.2 正交实验结果

表2 正交实验设计与结果

表3 方差分析表

根据表2和表3，影响无患子果皮皂苷提取得率的影响因素从大到小依次为：丙酮溶液体积分数、温度，时间、固液比，即A>B>C>D,可得出最佳提取工艺为A2B1C3D2，即提取的丙酮溶液体积分数为80%，提取时间 90 min，提取温度 85 ℃，料液比3∶10.

3.6 验证试验

根据正交试验得到的最佳提取工艺条件A2B1C3D2，即提取的丙酮溶液体积分数为80%，提取时间 90 min，提取温度 85 ℃，料液比3∶10，在该条件下按照1.2.2提取方法进行3次试验，提取率分别为5.71%、5.69%、5.75%，无患子果皮皂苷得率为5.72%.与正交试验中的高提取率5.77%差值为0.05%.误差为0.867%小于5%.

4 结语

本文采用索氏提取法，丙酮为提取剂提取无患子果皮中的皂苷.通过单因素实验、正交实验、显色剂比对以及分光光度法测得皂苷得率，考察丙酮体积分数、提取时间、提取温度、固液比对无患子皂苷提取工艺的影响，最佳提取工艺条件为：丙酮溶液体积分数为80%，提取时间 90 min，提取温度 85 ℃，料液比 3∶10，得率为5.72%.