MiR-199b-3p、miR-373、miR-548c-3p及Lin28在肺癌中表达及其意义

刘 敏，张若冰，杨凯云，尚 莉,平妮娜,何越峰

(1.昆明医科大学 图书馆，云南 昆明 650500；2.昆明医科大学 公共卫生学院，云南 昆明 650500；3.昆明医科大学 第三附属医院胸心外科 云南 昆明 650500)

微小RNA(microRNA，简称miRNA)是一种内源性的单链小分子RNA，成熟体通常约为20-25nt，miRNA可参与细胞的生长、代谢以及死亡与凋亡等多种细胞正常活动，近10年的研究证明miRNA介导着肿瘤的发生与发展以及治疗[1].肺癌是发病率致死率都高的一种疾病，随着对miRNAs的研究增多，发现在人类各种癌症类型中均有miRNAs表达异常[2]，有研究证实部分miRNAs具有癌基因或者抑癌基因的调控功能，并且miRNAs可预示肿瘤的发生和发展时期，对肺癌的进展有着影响的作用[2-4].有研究显示miR-199b-3p可以促进红细胞的分化[5],miR-373可以通过激活wnt/β-acting信号转录而促进肿瘤的发生[6]，Lin-28及其旁系参与细胞的生长和代谢，以及抑制癌细胞的增长，在胚胎细胞中表达量较高[7-8].本文采用实时荧光定量PCR(Q-PCR)技术,检测miR-199b-3p、miR-373、miR-548c-3p、Lin28在肺癌组织与癌旁组织中的表达量，分析这些miRNA与吸烟、饮酒、临床TNM分期、以及癌组织中常见的免疫组织化学指标谷胱甘肽-s-转移酶(GSTPπ)、P-糖蛋白(PGP)、DNA拓扑异构酶Ⅱ(TOPOⅡ)等的关系，探讨这些基因在肺癌发生发展过程中的可能作用.

1 对象和方法

1.1 组织收集保存

选择 2010—2014年在云南省肿瘤医院进行外科手术的肺癌住院患者，取得知情同意后，收集患者手术中切除的癌组织与癌旁正常组织.癌旁正常组织的选取标准：需距离癌组织 5 cm以上.将取下的组织放入RNAlater(美国ambition公司)溶液中(8 min内)，后把浸泡组织的溶液放置于 4 ℃冰箱中，8 h 后可放入-80 ℃冰箱长期保存.术后查阅组织的病理切片结果来确定组织的病理类型，符合实验条件的病例共有46例，其中14例鳞癌，32例腺癌.接着收集患者的临床流行病学资料(包括年龄、性别、吸烟、饮酒、民族等)，以及免疫组织化学方面的资料，包括TOPOⅡ(DNA拓扑异构酶Ⅱ)、LRP(肺耐药相关蛋白)、MRP(多药抗性蛋白)、P53、Ki-67等.

1.2 RNA的提取和定量

用TRIzol试剂盒(美国Invitrogen公司)提取总RNA，NCodeTMEXPRESS SYBR® GreenERTMmiRNA qRT-PCR Kit (A11193-052)进行逆转录，以上步骤按试剂盒说明书进行.引物序列分别为：MiR-199b-3p CGACAGTAGTCTGCACATTGGTTA.hsa-miR-373 TGCTTCGATTTTGGGGTGT.miR-548c-3p GGCAAAAATCTCAATTACTTTTGC，miRNA下游引物为试剂盒提供.Lin28 CAAAAGGAAAGAGCATGCAGAAG,GCATGATGATCTAGACCTCCACA .利用荧光定量系7900ht(美国ABI公司)对4个目标基因进行Q-PCR检测，基因的相对表达量用-△△CT表示.

1.3 数据处理

2 结果

2.1 病例的基本情况

收集的46例样本基本情况如下：所有的患者均为汉族；组织类型：32例腺癌，14例鳞癌；年龄32～71岁，平均年龄(54.91±9.62)岁；患者男女比例为 31∶15；吸烟与饮酒的例数分别为：29、22例；高、中、低分化分别为：1、27、18 例；32例腺癌的免疫组织化学指标(详见下表1)，KI67：5%～90%中位数为25.00%.

表1 32例腺癌的免疫组织化学指标

2.2 基因在肺癌组织及对应的癌旁组织中表达变化

使用成组t检验比较，肺癌组织中miR-373、lin28及miR-548c-3p基因相对于癌旁组织中的表达均有差异，具有统计学意义，其中肺癌组织中miR-373较癌旁组织表达显著上调.肺癌中的lin28、miR-548c-3p较癌旁组织低，表达呈下调(详见表2).

基因肺癌组织正常组织miR-199b-3p5.77±1.785.24±2.1miR-3734.21±2.29∗∗6.04±2.01miR-548c-3p7.61±2.66∗∗5.73±3.20Lin287.66±3.01∗∗5.78±2.84

注：*P<0.05,**P<0.01.

2.3 肺癌组织中RNA与免疫组织化学指标的关系

用Spearman秩相关分析肺癌组织中基因表达与免疫组织化学指标的关系，miR-199b-3p与MRP(Rs=0.40，P=0.029)、饮酒(Rs=0.32，P=0.043)呈正相关关系，miR-548c-3p和Ki167呈正相关关系(Rs=0.52，P=0.0056)，miR-373与K167呈正相关关系(Rs=0.43，P=0.029)，Lin28与P53呈负相关关系(Rs=-0.43，P=0.022)，还与PGP呈负相关关系(Rs=-0.38，P=0.034)(详见表3).

表3 MiR-199b-3p、miR-373、miR-548c-3p及Lin28基因表达与临床各指标GSTPπ、PGP、TOPOⅡ、LRP、MRP、P53、KI67的之间关系

2.4 miR-373与miR-548c-3p在肺癌及其正常组织中表达关系

使用线性回归分析肺癌组织中基因表达之间的关系，发现miR-373与miR-548c-3p在肺癌及其正常组织中表达成呈正相关如图1所示，其他基因之间不存在相关关系.

3 讨论

越来越多的人类miRNAs基因被证实与癌症有关[9]，miRNA基因表达量与多种肿瘤相关，并参与不同类型的肿瘤转移过程[10-11].miRNA可调控目标基因mRNA翻译水平，近几年来大量的miRNA被定义为致癌基因或抑癌基因，如，在乳腺癌中miR-335，miR-206,及miR-126被视为癌症转移的标志，宫颈癌中miR-126，miR-143及miR-145和肺癌基因中的miR-451被视为致癌基因[7,12].

有研究证实miR-199b-3p与多种癌症发生发展相关，李首庆等研究中发现miR-199b-3p在4种高迁移侵袭性的乳腺癌细胞株中表达呈明显下调[13]，Gao[14]等发现在骨肉瘤中的miR-199b-3p呈低表达，Slattery等[15]发现在结肠癌组织中miR-199b-3p表达上调.在本研究中，肺癌组织的miR-199b-3p与癌旁组织比较差异无统计学意义.有研究证实miR-373在肝细胞癌组织和人胃癌细胞系MKN-45细胞中表达上调[16-17]，胰腺癌患者血清miR-373表达水平明显下调[18].本研究发现肺癌组织中的miR-373基因表达呈下调，miR-373基因的表达与癌症的发生发展的关系以及机制可能比较复杂.miR-548c-3p在肿瘤研究中甚少，有研究证明miR-548c在乳腺癌组织中起到了抑制癌基因的作用，在本文肺癌组织中较癌旁组织基因表达差异具有显著性，在肺癌组织中表达呈上调.Lin28是一个高度保守的结合蛋白RNA[19]，有研究发现在人类肺癌、卵巢癌、口腔鳞状细胞癌和胶质瘤中Lin28表达异常[20-23]，在结肠癌中的表达上调[24]，在乳腺癌中的表达下调[25].本研究中肺癌组织中Lin28基因在肺癌组织中表达呈上调.各基因与临床各指标的之间关系分析发现，miR -b199b-3p与MRP呈正相关关系；miR-548c-3p和KI67呈正相关关系；miR-373与KI67呈正相关关系；Lin28与P53、PGP呈负相关关系从一个侧面说明上述基因与肺癌的发生关系密切.MiR-373与miR-548c-3p在肺癌及其正常组织中表达成呈正相关，说明二者可能存在类似的调控通路中.

本研究中证实在肺癌疾病中，miR-373在肺癌疾病中基因表达下调.而miR-548c-3p与Lin28基因表达呈上调，推测由于Lin28是一个高度结合蛋白RNA，其主要的生物学功能为控制癌细胞的增长，而miR-373主要功能为促进肿瘤的发生，而在肺癌组织中，Lin28与miR-373基因结合后，Lin28抑制或降解miR-373基因，从而促使miR-373基因的表达下调，KI67是一种评价增值细胞的重要指标，在相关性分析中miR-373基因的表达影响指标的表达，推测miR-373基因促进细胞的增值作用.

肺癌是发病率最高的癌症，也是最常见的威胁人类生命的肿瘤，尚缺乏早期诊断方法，使其成为世界范围内病死率最高的肿瘤之一[26].本研究得到了miRNAs、mRNA与肺癌之间的关系的流行病数据，但研究中对Lin-28仅限于关联研究，下一步可从细胞学及其分子生物方面进行深入探索.本次研究的意义在于通过对Lin-28与miRNAs关系的探究，明确肺癌与miRNAs异常表达有关，接下来应从miRNA调控方面入手，深度研究miR-373以及miR-548c-3p的表达基因，对阐明miRNAs表达调控或降解机制中的重要意义.