基于UPLC-QTOF-MS/MS 技术分析荷叶乙酸乙酯相中主要化学成分

张 露，王红红，杨斯涵，涂宗财,2,*，李 军，陈 娟，黄玉珠

（1.江西师范大学 国家淡水鱼加工技术研发专业中心，江西省淡水鱼高值化利用工程技术研究中心，江西 南昌 330022；2.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047）

莲（Nelumbo nucifera Gaertn）是莲属多年生根茎类水生植物，在中国、印度、韩国、泰国、日本等亚洲国家被广泛种植。它不仅是一种观赏植物，也是广受欢迎的药食两用资源，药典记载，荷叶是治疗腹泻、血尿、咯血、炎症和发热等疾病的重要中药[1]。药理学研究证明，荷叶提取物及其化学成分具有一系列保健效果，如降血糖[2]和降血脂[3]、抗癌[4]、抗肥胖症[5]、抗真菌[6]、镇静安神和抗焦虑[7]、抗氧化等作用[8]。目前已在荷叶中发现的活性成分主要有多糖[9]、多酚[4]、黄酮[2]、生物碱[7]、有机酸[10]和megastigmanes[5]。但每年莲子收获后，除少部分用作食品烹饪、食品加工和保健品加工的原料外，大部分荷叶仍作为废弃物丢弃，没有得到有效的利用。

晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）是指大分子物质，如蛋白质、脂类及核酸等的游离氨基与还原糖的醛基通过糖基化反应生成的一大类稳定化合物。人体中AGEs的积累在动脉粥样硬化、尿毒症、阿尔茨海默病、白内障、糖尿病并发症等慢性疾病的发生和发展中起着重要作用[11-12]。高蛋白、高油脂和高糖食品在热加工和贮存过程中容易形成AGEs[13-14]。Jung等[15]研究发现，荷叶提取物能有效抑制牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）-葡萄糖体系糖基化过程中AGEs的形成，本课题组前期研究也发现，荷叶提取物及其乙酸乙酯相通过抑制BSA聚集和构象展开可有效抑制AGEs的形成[16]，但其具体活性成分仍有待进一步研究。因此，本实验拟采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time of flight-tandem mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS/MS）技术对荷叶乙酸乙酯相中的主要化学成分进行鉴定，以期为荷叶资源在食品加工和功能性食品开发领域的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜荷叶采自江西省赣州市石城县；乙腈、甲酸（均为色谱纯） 德国Merck公司；乙醇、乙酸乙酯（均为分析纯） 天津市大茂化学试剂厂；实验用水为Milli-Q制备超纯水。

1.2 仪器与设备

KQ5200DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；UPLC LC30系统、Shim-pack GIST C18色谱柱（2.1 mm×75 mm，2 μm） 日本Shimadzu公司；Hybrid QTOF-MS/MS系统（配有Shortcut to Peakview数据处理工作站） 美国AB Sciex公司；N-1100旋转蒸发仪日本Eyela公司。

1.3 方法

1.3.1 荷叶乙酸乙酯相的制备

参照前期研究的方法制备荷叶乙酸乙酯相[16]。干荷叶粉末样品按照1∶20（g/mL）的比例与90%乙醇溶液混匀，于500 W、50 ℃超声处理30 min后，4 000 r/min离心8 min，收集上清液，沉淀再在相同条件下提取、离心2 次。合并上清液，并旋转蒸发浓缩至膏状。膏状提取物用少量蒸馏水溶解后依次用二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，每个溶剂萃取3～4 次，合并相同萃取组分，将乙酸乙酯相旋转蒸发浓缩后冷冻干燥，于-20 ℃保存。HPLC分析前，将乙酸乙酯相用90%乙醇溶液溶解，配成1 mg/mL的溶液。

1.3.2 活性成分鉴定

1.3.2.1 色谱条件

采用UPLC LC30系统分离乙酸乙酯相中的化学成分，样品过0.22 μm有机微孔薄膜后上样分析。UPLC条件：二极管阵列检测器；自动进样器；Shim-pack GIST C18色谱柱（2.1 mm×75 mm，2 μm）；洗脱溶剂为0.1%甲酸（洗脱剂A）和乙腈（洗脱剂B）；流速0.2 mL/min；柱温25 ℃；进样量5 μL；梯度洗脱：0 min，10% B；6 min，12% B；16 min，20% B；29 min，22% B；40 min，95% B；操作系统：AB Sciex Analyst®1.7.1工作站。

1.3.2.2 MS条件

采用Hybrid Q-TOFMS/MS系统获得化合物的质谱信息。MS条件：电喷雾离子源；质量扫描范围m/z 100～1 500；碰撞气为氦气；辅助气体和屏蔽气体为氮气；喷雾电压-4.5 kV；离子源温度550.0 ℃；辅助气和喷雾气压力50.0 psi；气帘气压力35.0 psi；裂解电压-80 V；MS碰撞能-10 eV；MS/MS碰撞能（-30±15）eV。采用Peakview®2.2软件从基峰图中得到化合物的保留时间、母离子、碎片离子等信息。

1.4 数据处理

采用PeakView软件对样品的wiff质谱文件进行处理，提取每个峰的m/z、保留时间、MS/MS碎片离子，并计算对应的分子式和偏差。采用ChemDraw软件绘制化合物的结构图和裂解规律图，采用Origin 8.0绘制样品的总离子流图。

2 结果与分析

2.1 乙酸乙酯相中化合物分析

荷叶中的主要活性成分为黄酮类化合物，其次为酚酸类，目前荷叶中已鉴定出的黄酮类化合物有39 种，包括黄酮醇类、黄酮类、花青素类、黄烷酮类、黄烷-3-醇类。根据黄酮苷元的组成，黄酮醇类分为杨梅黄酮、槲皮素、山柰酚和异鼠李素4 类；黄酮类包括香叶木素、丁香亭、芹黄素、木犀草素和金圣草素；花青素类包括矢车菊素、飞燕草色素、锦葵色素、矮牵牛素和芍药素；黄烷酮类包括柚皮素和花旗松素。黄烷-3-醇类的单聚体包括儿茶素、表儿茶酸鼠李糖苷、表儿茶素、没食子儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素没食子酸酯；黄烷-3-醇类的二聚体和多聚体分别为原花青素二聚体B1和(＋)-3,4,5,6,7,8-六羟基黄酮-3-醇；已鉴定出的酚酸为11 种，包括咖啡酸、原儿茶酸、绿原酸、肉桂酸、阿魏酸、对香豆酸、芥子酸、没食子酸、对羟基苯甲酸、丁香酸和香草酸[1,17]。

图1 荷叶乙酸乙酯相的HPLC基峰色谱图Fig. 1 HPLC base peak chromatograph spectra of the ethyl acetate fraction from lotus leaves

如图1、表1所示，根据化合物的母离子、分子式、MS/MS碎片离子、保留时间等信息，并结合参考文献和相关数据库（Chemspider和Metlin）对化合物的结构进行初步鉴定。与前期研究结果相似，黄酮类化合物为荷叶乙酸乙酯相中的主要化学成分，其次为酚酸[16]，本实验共从荷叶乙酸乙酯相中检测到27 种黄酮类化合物、6 种酚酸类化合物、4 种有机酸、2 种脂肪酸和1 种氨基酸。

2.2 黄酮类化合物的鉴定

图2 负离子模式下黄酮苷元（a）、黄酮-C-六碳糖苷（b）和黄酮-C-五碳糖苷（c）的特征MS/MS裂解规律Fig. 2 Characteristic MS/MS fragmentation patterns of flavone aglycone (a), flavone-C-hexoside (b) and flavone-C-pentoside (c) under negative ion mode

不同类型的黄酮苷元和黄酮糖苷在负离子模式有其特征裂解模式，黄酮苷元在负离子模式下的特征裂解规律如图2a所示，A和B环左上方的数字表示断裂键的位置，1,3A-和1,4A-产生的片段的分子质量分别为119＋16n1和91＋16n1（n1为A环上羟基的数目）；1,3B-和1,4B-产生片段的分子质量分别为101＋16n2和129＋16n2（n2为B和C环上羟基总数）；0,4B-产生的片段的分子质量为145＋16n2；1,2B-产生的片段的分子质量为74＋16n2。以槲皮素为例，1,3A-、1,4A-、1,3B-、1,4B-的分子质量分别为151、123、149 u和177 u（A环2 个羟基、B环2 个羟基、C环1 个羟基）。另外，黄酮类更容易产生1,3A-和1,3B-碎片，而黄酮醇类倾向于产生1,2A-和1,2B-碎片[18]。

荷叶中的黄酮糖苷主要是O-糖苷、C-糖苷和O-二糖苷。可以通过分析这些化合物的HPLC-MS/MS碎片离子区分糖的取代位置和数目。对于O-糖苷类化合物，Y0-为基峰且有高强度或者较高的[Y0-H]-响应时表明糖连接在3-OH位置。对于C-糖苷类化合物，负离子模式下会产生特征碎片离子[M-H-150]-、[M-H-120]-、[MH-90]-和[M-H-60]-[19]，六碳糖苷和五碳糖苷的糖部分在负离子模式下的特征裂解模式如图2b、c所示。另外，C-糖苷类化合物在负离子模式下很难产生Y0-碎片，但苷元部分的分子质量可以根据MS/MS碎片离子中丰富的0,2X-（[苷元＋42-H]-）和0,3X-（[苷元＋72-H]-）片段推测出来[20]。

本实验共从荷叶乙酸乙酯相中检测到27 个黄酮类化合物。峰40的母离子为m/z 301.035 5（C15H10O7），其MS/MS离子m/z 273.040 4和m/z 245.045 6分别为母离子丢失1 个CO和2 个CO所产生，产物离子m/z 229.051 0、178.998 5、151.003 8、121.029 6和107.014 0对应的片段分别为[M-CO-CO2-H]-、0,4B-、1,3A-、1,2B-和0,4A-，因此峰40鉴定为槲皮素。按照相同的推断方法，峰37、38分别鉴定为二羟基黄酮和圣草酚[21]，圣草酚的MS/MS裂解途径如图3A所示。

表1 荷叶乙酸乙酯相中鉴定或初步鉴定的化学成分Table 1 Identification or tentative identification of chemical constituents in the ethyl acetate fraction of lotus leaves

峰17、19、20、21、22、24、26、32中均有特征碎片离子m/z301.04（Y0）和m/z300.03（[Y0-H]-），因此它们被鉴定为槲皮素-3-O-糖苷[22]。峰17（[M-H]-，m/z595.131 6）、峰19（[M-H]-，m/z609.146 3）、峰21（[M-H]-，477.067 8）和峰32（[M-H]-，m/z447.092 8）的苷元离子m/z301.04分别由其母离子脱去戊糖基己糖基（-294 Da）、鼠李糖基己糖基（-308 u）、葡萄糖醛酸基（-176 u）和鼠李糖基（-146 Da）部分所产生，因此峰17、19、21和32分别鉴定为槲皮素-3-O-戊糖基己糖苷、芦丁、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸和槲皮素-3-O-鼠李糖苷。峰20、22鉴定为槲皮素-3-O-己糖苷，苷元离子m/z301.04为母离子中性丢失己糖基部分（-162 u）所产生。峰24、26的母离子[M-H]-均为m/z433.078（C20H18O11），MS/MS离子m/z301.04为母离子中性丢失戊糖基部分（-132 u）产生，因此峰24和峰26鉴定为槲皮素-3-O-戊糖苷。相似地，峰43、25、27和28分别鉴定为山柰酚、山柰酚-3-O-己糖苷、山柰酚-3-O-己糖苷和山柰酚-3-O-葡萄糖醛酸[23]。峰30的MS/MS产物离子m/z 299.055 3、285.039 2和255.028 2对应的片段分别为[M-C6H10O5-H]-、[M-C6H10O5-CH2-H]-和[M-C6H10O5-CH2-CH2O-H]-，表明化合物中存在1 个六碳糖和甲基，因此峰30鉴定为山柰素-3-O-己糖苷。按照相同的推断方法，峰36鉴定为二甲基槲皮素-3-O-己糖苷。

图3 圣草酚（A）、异鼠李素-3-O-葡萄糖醛酸（B）和4-(2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl)butanoat（C）的MS/MS裂解途径Fig. 3 Possible MS/MS fragmentation patterns of eriodictyol (A),isorhamnetin-3-O-glucuronide (B) and 4-(2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl)butanoat (C)

峰2 9、3 1、3 5和3 9的母离子[M-H]-分别为m/z 477.103 4（C22H22O12）、m/z 491.083 8（C22H20O13）、m/z 609.146 9（C27H30O16）和m/z 477.104 3（C22H22O12），其共同的产物离子315.05分别由母离子中的己糖基、糖醛酸基、戊糖基己糖基和己糖基部分断裂所产生。另外，MS/MS特征碎片离子m/z 315.05（Y0-）、314.04（[Y0-H]-）、301.04（[Y0-CH2-H]-）、299.020 7（[Y0-CH3-H]-）表明这些化合物的苷元为异鼠李素，且糖部分链接在3 位羟基。因此，峰29、31、35和39分别鉴定为异鼠李素-3-O-己糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖醛酸（图3B）、异鼠李素-3-O-戊糖基己糖苷和异鼠李素-3-O-己糖苷[24]。峰16的母离子[M-H]-为m/z 479.082 9（C21H20O13），其MS/MS产物离子m/z 317.029 4和m/z 316.022 4表明苷元部分为四羟基黄酮，分子式为C15H10O8，且六碳糖连接在3-OH，根据文献报道，荷叶中存在杨梅素-3-O-葡萄糖苷[10]，因此峰16鉴定为杨梅素-3-O-葡萄糖苷。

本研究从荷叶乙酸乙酯相中检测到5 个黄烷-3-醇类化合物。通过与文献中的二级质谱数据比较，峰8和峰9分别鉴定为儿茶素和表儿茶素[25]，这2 个化合物已在荷叶中鉴定[5,17]。峰7和峰15鉴定原花青素二聚体[26]。峰34的母离子[M-H]-为m/z 591.150 8（C31H28O12），其MS/MS产物离子m/z 439.102[M-C7H4O4-H]-和m/z 289.069 9 [M-C7H4O4-C5H8O4-H]-为母离子中的没食子酰基和五碳糖部分相继断裂所产生，碎片离子m/z 289.069 9、245.080 2、215.071 5表明化合物中存在儿茶素结构，因此峰34鉴定为没食子酰儿茶素-戊碳糖苷。

2.3 酚酸类化合物鉴定

共鉴定出6 个酚酸类化合物（峰1、4、6、11、13和14）。峰1、4、6和14的母离子[M-H]-分别为m/z 169.014 3（C7H6O5）、153.019 4（C7H6O4）、137.024 5（C7H6O3）和m/z 163.040 1（C9H8O3），特征MS/MS碎片离子m/z 125.024 5、109.028 5、109.020 6和119.050 3分别为母离子丢失44、44、18 u和44 u所产生，通过与文献比较，峰1、4、6和14分别鉴定为没食子酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸和对香豆酸[22]。其中，原儿茶酸、对香豆酸和对羟基苯甲酸已在荷叶中鉴定[17]。峰11鉴定为二羟基香豆素[27]，MS/MS碎片离子m/z 149.023 7、133.028 3、105.033 2分别为母离子丢失1 个H2O、1 个CO2和1 个CO2＋H2O形成。峰13鉴定为阿魏酸[28]，碎片离子m/z 149.097 4和133.065 6分别由母离子相继丢失1 个CO2和1 个CH4所产生。

2.4 有机酸和其他类型化合物

共从荷叶乙酸乙酯相中检测到4 个有机酸类化合物（峰3、5、12和23）、2 个脂肪酸（峰41和42）和1 个氨基酸（峰2）。峰3的母离子[M-H]-为m/z 184.061 5，其计算分子式为C8H10NO4，产物离子m/z 140.071 8、124.040 1和112.039 7分别对应母离子丢失CO2、CO2＋CH4和CO2＋C2H4后所产生的碎片，通过与数据库中的结构式和MS/MS碎片信息进行匹对，峰3推测为4-(2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl)butanoat，其MS/MS裂解规律如图3C所示。采用相同的鉴定方法，峰5鉴定为homomevalonic acid，产物离子m/z 117.054 3[M-CO2-H]-和m/z 99.044 0[M-CO2-H2O-H]-表明化合物的结构中至少存在1 个羧基和1 个羟基。峰12鉴定为庚二酸，产物离子m/z 141.055 6和m/z 115.076 9分别由母离子丢失1 个H2O和1 个CO2所产生。

峰23的母离子[M-H]-为m/z 187.097 5，碎片离子m/z 169.086 5和m/z 125.097 0分别由母离子相继丢失1 个H2O和1 个CO2产生，其MS和MS/MS碎片信息与文献[29]报道的一致，因此峰23鉴定为壬二酸。通过与文献中化合物的裂解模式比较，峰2（[M-H]-m/z 131.034 8，C4H7N2O3）鉴定为天冬酰胺[30]。

峰41和峰42的分子式相差2 个氢原子，且具有相似的产物离子。化合物41的母离子[M-H]-为m/z 327.218 0，MS/MS离子m/z 309.207 1和m/z 291.196 7分别是母离子失去1 个H2O和2 个H2O所产生，碎片离子m/z 229.144 5和m/z 211.118 1依次是C12—C13键裂解和裂解形成的碎片再脱去1 个水分子所产生，碎片离子m/z 171.103 0是由C9—C10键断裂所产生，根据Zhang Lu等[31]报道，化合物41鉴定为9,12,13-三羟基十八碳癸二烯酸。同理，峰42鉴定为9,12,13-三羟基十八碳癸烯酸，其裂解途径如图4所示。

图4 9,12,13-三羟基十八碳癸烯酸的MS/MS裂解模式Fig. 4 Possible MS/MS fragmentation pattern of 9,12,13-trihydroxyoctadecenoic acid

3 结 论

本实验采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术对荷叶乙酸乙酯相中的主要化学成分进行定性分析。根据色谱峰的母离子、碎片离子、分子式和质谱裂解规律，结合相关文献和数据库，共从荷叶乙酸乙酯相中鉴定出40 种化合物，包括27 种黄酮类化合物、6 种酚酸、4 种有机酸、2 种脂肪酸和1 种氨基酸。其中黄酮类化合物以槲皮素、槲皮素糖苷、山柰酚、山柰酚糖苷、异鼠李素糖苷和黄酮-3-O-醇类为主，二羟基香豆素、9,12,13-三羟基十八碳癸二烯酸和9,12,13-三羟基十八碳癸烯酸为首次在荷叶中鉴定。同时描述了圣草酚、异鼠李素-3-O-葡萄糖醛酸、4-(2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl)butanoat和9,12,13-三羟基十八碳癸烯酸在负离子模式下的MS/MS裂解规律。本研究可为进一步探究荷叶乙酸乙酯相抑制AGEs形成的功效物质基础，以及其他生物活性的研究提供理论依据。