富硒平菇多糖对益生菌生长代谢的研究

郭 芸，李海涛，赵玉明，马 玲

（1.山西药科职业学院 食品工程系，山西 太原 030031；2.山西省生物研究所，山西 太原 030006；3.山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 晋中 030801）

富硒平菇多糖是从富硒平菇中提取出的一种含硒平菇多糖，是一种高分子多糖类的活性物质，因其具有硒，所以生物功能活性较普通平菇多糖大大提高。有关硒多糖较高的抗氧化、提高免疫、抗肿瘤功能活性的报道很多[1-4]。一般的微生物不能直接利用多糖作为碳源，而益生菌可以利用其进行生长代谢并产生对人体有益的短链脂肪酸，从而发挥益生元的功效。有关多糖促进益生菌生长代谢的报道较多，刘丽莎等[5]对白术多糖对益生菌的促生长作用进行了研究，发现对婴儿双歧杆菌（Bifidobacterium infantis）、青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolesentis）、动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）的促生长效果最佳。赵玉萍[6]对真菌多糖促进鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）生长进行了研究，发现质量浓度为15 g/L的真菌多糖可以显著促进鼠李糖乳杆菌的增殖，其活菌数最大可达到3.08×1010个/mL，能够使发酵周期提前2～3 h。TADAYONI M 等[7]研究发现，橡子粗多糖与菊粉相比可以显著促进植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）A7的生长。WANG X等[8]研究报道，油菜籽多糖可以促进益生菌的生长（双歧杆菌（Bifidobacterium）、青春乳杆菌（Lactobacillus infantis）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）等），AKBARI-ALAVIJEH S等[9]研究发现，开心果水溶性多糖促进了植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）PTCC 1896和鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）的增殖，同时增加了乙酸、丙酸、丁酸的生成量。

本研究通过水提醇沉提取富硒平菇粗多糖，在植物乳杆菌和副干酪乳杆菌两种益生菌培养中加入不同量的硒多糖，以菊粉为阳性对照，通过测定益生菌活菌数以及代谢过程中的产物，研究富硒平菇多糖对益生菌生长代谢的影响，为富硒平菇多糖在益生菌中的应用提供一些基础理论，进一步为开发新型益生元、丰富益生菌代谢理论提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

平菇（硒含量37.81 mg/g干样）、富硒平菇（硒含量622.47 mg/g干样）：山西紫团生态农业有限公司；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）：山西农业大学食品科学与工程学院畜产品加工实验室。

1.1.2 化学试剂

蛋白胨（生化试剂）：天津市鼎盛鑫化工有限公司；牛肉浸膏、酵母膏（均为生化试剂）：天津市大茂化学试剂厂；无水葡萄糖（分析纯）、琼脂粉（生化试剂）：天津市凯通化学试剂有限公司；磷酸氢二钾、柠檬酸氢二铵、无水乙酸钠（均为分析纯）：天津市申泰化学试剂有限公司；硫酸镁、硫酸锰（均为分析纯）：天津市恒兴化学试剂制造有限公司；菊粉（食品级）：上海蓝季科技发展有限公司。

1.1.3 培养基

酸化MRS琼脂培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏10g，酵母提取物5 g，磷酸氢二钾2 g，柠檬酸铵2 g，乙酸钠5 g，葡萄糖20 g，吐温-80 1 mL，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，pH 5.6。121 ℃灭菌15 min。

1.2 仪器与设备

HPP-9272恒温培养箱：北京东联哈尔仪器制造有限公司；ST16R台式冷冻离心机：美国Thermo公司；FE28-Standard pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；LDZF-30KB立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；CP114精密电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；85-2恒温磁力搅拌器：金坛市城东新瑞仪器厂；1260 infinity型高效液相色谱仪：安捷伦科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 富硒平菇多糖的制备

将富硒平菇粉碎后按料水比1∶20（g∶mL）加入蒸馏水，在80 ℃条件下水浴搅拌提取3 h，抽滤后收集滤液，重复提取3次，将滤液合并后真空浓缩，加入4倍体积的无水乙醇，4 ℃静置过夜，4 000 r/min、10 min离心将沉淀取出，用适量水溶解后加入Sevag 溶液（氯仿∶正丁醇=4∶1，V/V）除蛋白，反复3次，用适量水溶解后对水透析48 h，冷冻干燥即得含硒粗多糖[10-11]，测得粗多糖硒含量为3.21 μg/g。普通平菇粗多糖按照同样的方法提取，测得硒含量为0.38 μg/g。

1.3.2 富硒平菇多糖对益生菌生长的影响

将植物乳杆菌和副干酪乳杆菌分别在MRS液体培养基中于37 ℃进行活化，然后将活化好的植物乳杆菌和副干酪乳杆菌分别以1%接种量（约106CFU/mL）接种于添加2%平菇多糖和0.5%、2.0%的富硒平菇多糖的无葡萄糖MRS培养基中，以添加2%菊粉作为阳性对照，以添加2%葡萄糖的MRS作为普通对照，37 ℃培养24 h、48 h 后测定活菌数、pH以及有机酸生成量。

1.3.3 分析检测

活菌数测定[12-13]：MRS 培养基，稀释平板计数法；pH值的测定[14]：采用pH 计直接测定。

有机酸的测定[9，15]采用HPLC法，取发酵48 h的不同处理的发酵液，4 ℃条件下4 000 r/min离心20 min，上清液过0.22 μm的水膜，收集滤液进行测定，其色谱条件如下：色谱柱Accucore C18反向柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；柱温30 ℃；流动相0.015 mol/L的磷酸二氢钾缓冲溶液-乙腈溶液，用磷酸将pH调至2.7；流速0.8 mL/min；进样量20 μL；紫外检测波长210 nm。通过和标准品进行比对定性，以峰面积计算各有机酸的相对含量。

2 结果与分析

2.1 不同处理对益生菌菌落数的影响

不同处理对副干酪乳杆菌（A）及植物乳杆菌（B）菌落数的影响结果见图1。由图1A可知，添加平菇多糖及富硒平菇多糖对副干酪乳杆菌发酵不同时间后菌落数有很大的影响，以2%葡萄糖作为对照组，发酵24 h后普通平菇多糖、不同浓度的富硒平菇多糖都使得副干酪乳杆菌的菌落数增加但差异不显著（P＞0.05），而菊粉组（活菌数对数值8.9）增加显著（P＜0.05），0.5%富硒平菇多糖组（活菌数对数值8.6）较2%富硒平菇多糖组（活菌数对数值8.4）促进效果更好，但都低于2%菊粉的促进效果。说明适当浓度的硒多糖促进了副干酪乳杆菌的增殖，而较高浓度硒多糖会一定程度抑制其增殖。培养48 h后的副干酪乳杆菌其菌落数都相应较24 h降低，进一步证明随着培养时间延长，培养基的营养减少限制了副干酪乳杆菌的增殖，有一部分菌还会受到代谢产物的损失而死亡。但各多糖组菌落数仍然显著高于葡萄糖对照组（P＜0.05），2%硒多糖组（活菌数对数值8.3）显著高于普通多糖组（活菌数对数值8.1）（P＜0.05），同时也高于菊粉组（活菌数对数值8.2）（P＞0.05），充分说明添加硒多糖后有利于长时发酵条件下保持益生菌的活性，可能与硒对菌体在不良环境下的胁迫具有较好的保护作用有关，可能与硒被益生菌吸收后提高了自身的抗氧化酶的活性有关，也可能与发酵过程中的代谢产物如短链脂肪酸等作用有关[14，16]。

图1 不同处理对副干酪乳杆菌（A）及植物乳杆菌（B）菌落数的影响Fig.1 Effect of different treatments on the viable count of Lactobacillus paracasei(A)and Lactobacillus plant(B)

由图1B可知，添加平菇多糖及富硒平菇多糖对植物乳杆菌菌落数的影响不同，不同的培养时间也对植物乳杆菌菌落数的影响不同，以2%葡萄糖作为对照，发酵24 h后各处理组植物乳杆菌的菌落数显著增加（P＜0.05），其中0.5%的富硒平菇多糖组（活菌数对数值8.4）高于其他处理组，但低于2%菌粉组（活菌数对数值8.6），发酵48 h后各处理组的菌数都相应下降，平菇多糖及富硒平菇多糖组菌数显著高于对照组（P＜0.05），其中2%的富硒平菇多糖组（活菌数对数值8.3）显著高于其他组（P＜0.05）。

2.2 不同处理对pH的影响

不同处理对副干酪乳杆菌及植物乳杆菌pH的影响结果见图2。由图2A可知，添加平菇多糖和富硒平菇多糖对副干酪乳杆菌发酵后pH的影响不同，不同的培养时间也对副干酪乳杆菌pH的影响不同。发酵24 h后，以2%葡萄糖作为对照组（pH 4.1），2%普通平菇多糖（pH 4.6）和0.5%、2%富硒平菇多糖组（pH 4.4，pH 4.7）pH下降不明显，而2%菊粉组经副干酪乳杆菌发酵后pH（pH 3.9）较低。随着发酵时间的延长，不同处理下副干酪乳杆菌发酵液的pH进一步降低，但各处理组pH（pH分别为4.2、4.3、4.1）都高于对照组（pH 3.9）。

图2 不同处理对副干酪乳杆菌（A）及植物乳杆菌（B）发酵液pH值的影响Fig.2 Effect of different treatments on the pH of fermentation borth by Lactobacillus paracasei (A) and Lactobacillus plant (B)

由图2B可知，添加平菇多糖及富硒平菇多糖对植物乳杆菌发酵后pH的影响不同，不同的培养时间也对植物乳杆菌发酵后pH的影响不同，发酵24 h后，与2%葡萄糖（pH 4.1）作为对照，2%普通平菇多糖（pH 4.6）和不同浓度的富硒平菇多糖（pH 4.4、4.7）对植物乳杆菌发酵后pH值下降不明显，都较菊粉组pH值高。经过48 h发酵后各组pH值都进一步降低，说明培养基中的多糖都可以被植物乳杆菌进一步利用，仍然以菊粉组的pH值（pH 3.5）最低，各多糖组pH值都高于对照组，而其中2%平菇多糖和0.5%富硒平菇多糖pH值接近（pH 4.3）。

2.3 不同处理对有机酸的影响

多糖一般不能被胃肠液中的酶分解，一般的细菌也很难利用其进行生长，而益生菌可以利用其代谢生成甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸，其中的丙酸作为糖异生的前体底物对糖尿病人和肥胖症有很好的功效[15]，乙酸在糖异生和脂代谢中扮演信号分子的作用，丁酸通过营养结肠细胞近而起到预防结肠癌的作用[17]，因而分析益生菌在生长过程中生成的短链脂肪酸是评价其益生作用的一个重要方面[18-19]，益生菌利用多糖发酵的速率取决于自身的酶系统和多糖的结构以及多糖的聚合度[9，20]。副干酪乳杆菌和植物乳杆菌两种益生菌在添加不同浓度多糖后发酵48 h生成有机酸结果见表1。

由表1可知，添加平菇多糖及富硒平菇多糖都提高了副干酪乳杆菌和植物乳杆菌代谢生成甲酸、乙酸、丙酸、丁酸四种有机酸含量，其中添加0.5%富硒平菇多糖显著提高了副干酪乳杆菌发酵后生成甲酸和丙酸的含量（P＜0.05），而2%富硒平菇多糖显著提高了副干酪乳杆菌发酵生成甲酸、乙酸、丙酸和丁酸的含量（P＜0.05），且最终浓度与2%菊粉差异不显著（P＞0.05），充分说明平菇硒多糖可以促进副干酪乳杆菌发酵后代谢形成短链有机酸，从而实现益生功能。与2%葡萄糖相比，添加0.5%富硒平菇多糖的植物乳杆菌发酵48 h后丁酸、乙酸、丙酸的含量显著增加（P＜0.05），而添加2%富硒平菇多糖的植物乳杆菌发酵48 h后丁酸、甲酸、乙酸、丙酸的含量分别显著增加到0.41 mg/mL、0.49 mg/mL、3.61 mg/mL、4.25 mg/mL（P＜0.05），但与2%菊粉组差异不显著（P＜0.05）。

表1 不同处理组发酵48 h后有机酸的含量Table 1 Contents of organic acids after fermentation for 48 h with different treatments mg/L

3 结论

2%富硒平菇多糖对发酵48 h副干酪乳杆菌的增殖效果优于菊粉，对植物乳杆菌的增殖效果与菊粉相当。平菇多糖和富硒平菇多糖促进了副干酪乳杆菌和植物乳杆菌代谢生成短链有机酸的含量，其中2%富硒平菇多糖的促进作用更强，两种益生菌发酵后的甲酸、乙酸、丙酸、丁酸含量分别比对照组（2%葡萄糖）提高了的340%、32.5%、43.4%、51.4%和122.7%、186.5%、183.3%、412.5%。发酵48 h后2%富硒平菇多糖能够保持较高的益生菌数量。平菇多糖和富硒平菇多糖经过两种益生菌发酵后pH下降不明显，但两种多糖有效促进了两种益生菌代谢生成甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸的水平，富硒平菇多糖促进作用更好，益生作用更强。