野生与养殖全蝎水提液中化学成分含量及抗病毒作用的对比研究

张瑞 毛会秀 桑晓 刘金虎 张欣欣 王集会 史磊 张珊珊

摘      要：为了观察比较野生与养殖全蝎冻干粉水提液中主要成分含量及其抗病毒作用，分别采用改良 Lowry法测定蛋白质含量， 阿利新蓝法测定糖胺聚糖含量，重量法测定醇提物含量， MTT法考察两种全蝎水提成分对HSV、RSV、EV71病毒的抑制作用。结果蛋白质含量、糖胺聚糖含量差异均无统计学意义。两者对病毒的抑制效果比较中，养殖全蝎水提液效果优于野生全蝎。经过两者间几个主要成分含量的比较以及抗病毒抑制作用的比较，野生与养殖全蝎原粉水提液中主要化学成分含量变化不大，但养殖全蝎抗病毒作用优于野生全蝎。

关  键  词：全蝎;冻干粉;蛋白质;糖胺聚糖;醇提物;抗病毒

中图分类号：R978.7       文献标识码： A       文章编号： 1671-0460（2019）06-1158-04

Abstract： To observe and compare the content of main components and its antiviral effect of water extracts of wild and cultivated scorpion freeze-dried powder， the protein content was determined by modified Lowry method，the glycosaminoglycan content was determined by Alcian blue method and the content of extract of alcohol was determined by refluxing method; MTT assay was used to investigate the inhibitory effects of two water extracts on HSV， RSV and EV71 viruses. The experimental data showed that there was no statistically significant difference in protein content and glycosaminoglycan content. In the comparison of inhibitory effect of two viruses， the effect of cultured whole scorpion water extract was better than that of wild whole scorpion water extract. After comparing the content of several main components and the antiviral inhibition between the two water extracts， the content of main chemical components in wild and cultured scorpion water extracts did not change much， but the anti-viral effect of cultured scorpion was better than that of wild scorpion.

Key words： Scorpion;  Freeze-dried powder;  Protein;  glycosaminoglycan;  Alcohol extract;  Antiviral property

全蝎为钳蝎科动物东亚钳蝎Buthus martensii Karsch的干燥体，是我国传统的中药材，主要产于山东、河南、河北等地，全蝎中含有蝎毒素类蛋白、酸性黏多糖等，辛、平，有毒[1]，有研究表明全蝎具有抗病毒的作用。但是全蝎药材的质量容易受多方面因素的影响，比如生长环境的改变、生长周期的延长、全蝎性别的不同、采收时间的不确定以及使用不完全相同的加工方法，这些条件的改变都会使全蝎的质量不均一，在临床上的效果也会有所改变。目前，由于野生全蝎资源越来越少，因此出現了大量的人工养殖全蝎，养殖全蝎和野生全蝎同样作为中药材使用，但其功效是否能完全代替野生全蝎未有充分研究，在之前的实验中我们用HPLC柱前衍生化测定野生与养殖全蝎中游离牛磺酸的含量[2]、野生与养殖全蝎酶解液体外抗Hep-2、A549肿瘤细胞株的实验[3]，结果表明养殖全蝎中的牛磺酸含量更高、抗肿瘤活性更强。因此通过对比野生与养殖全蝎水提液中化学成分含量和抗病毒作用，以期进一步了解两者的差别，为用养殖全蝎全面替代野生全蝎在生产和临床中的使用提供实验基础。

1  实验部分

1.1  仪器

双人单面生物安全柜（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）;Memment-CO2培养箱（北京五洲东方科技发展有限公司）; Mettler AE240 电子天平（瑞士梅特勒公司出品）;UV9100B可见分光光度计（北京莱伯泰科仪器有限公司）; LC-10AT VP（日本岛津公司出品）;ST16R高速冷冻离心机（默飞世尔科技（中国）有限公司）;TS-100型Nikon倒置显微镜（Japan）;EL340i 型全自动酶标仪（MoLecuLar Devices）;MSM-2008型超滤器（上海摩速科学器材）。

1.2  试剂

牛血清白蛋白（上海伯奥生物科技有限公司）;噻唑蓝（MTT）（齐鲁制药有限公司，批号：MFCD00011964）;阿利新蓝（上海麦克林生化科技有限公司，批号：C10102335）;利巴韦林（齐鲁制药有限公司）;硫酸软骨素（北京索莱宝科技有限公司，批号：20150914）; 1640 培养基、胎牛血清（赛默飞世尔生物制品北京有限公司）;其他试剂均为分析纯。

1.3  药材

养殖全蝎;野生全蝎;两种全蝎都从山东临沂采购，经高德民教授鉴定为东亚钳蝎。分别从野生全蝎和家养全蝎中挑选出成年蝎，洗净，在 -80 ℃ 冻干，粉碎，匀浆，冷冻干燥成粉，两者做同法处理。

1.4  细胞

猴胚胎肾细胞（MA104），细胞株由山东省立医院提供。

1.5  病毒

单纯疱疹病毒（HSV），呼吸道和胞病毒（RSV），手足口病毒（EV71），均由山东省立医院提供。

2  方法

2.1  全蝎水提液的制备[4]

分别取等质量的野生与养殖全蝎粉，加30倍体积水超声10 min，静置后再重复上述步骤2 次。提取液以3 000 r/min离心10 min，取上清液，即得全蝎水溶性提取物溶液。

2.2  蛋白质含量测定[5]

2.2.1  制备供试品溶液

分别精密移取两种全蝎粉水提液各1.00 mL，将其加入10 mL容量瓶中，用量筒加入定量的蒸馏水至容量瓶刻度线10 mL，静置片刻，用力震荡将两种水提液混合均匀，将其置于冰箱中用于接下来的含量测定。

2.2.2  制备对照品溶液

精密称取20.000 0 mg牛血清白蛋白，用蒸馏水定容至100 mL的容量瓶中，得到200 ?g·mL-1 的标准溶液，静置10 min，将其震荡使牛血清白蛋白充分溶解，放冰箱中用于接下来的含量测定。

2.2.3  制备标准曲线[6]

准备6支相同的10 mL试管，分别精密量取牛血清白蛋白溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL，将其分别加于试管中，加蒸馏水至1.00 mL，加2.00 mL碱性铜，震荡使其混合均匀，室温下放置大约10 min，然后快速精准加入0.20 mL酚试剂，在室温下静置30 min，在可见分光光度计620 nm处测定对照品牛血清白蛋白溶液的吸光度。横坐标为牛血清白蛋白溶液的浓度，纵坐标为测定的吸光度，根据横纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程，C为牛血清白蛋白溶液的浓度，A为测定的吸光度。

2.2.4  样品含量的测定

精密移取2.2.1下各供试品溶液以及空白溶液对照品1.00 mL置于10 mL刻度试管中，加碱性铜溶液2.00 mL，摇匀，室温放置10 min，快速加入酚试剂0.20 mL，室温放置30 min，于620 nm处测定野生全蝎和家养全蝎的吸光度。根据2.2.3得到的回归方程分别求得野生全蝎和家养全蝎中蛋白的含量，并通过分析得出是否具有显著性差异。

2.3  糖胺聚糖含量的测定[7]

2.3.1  配制阿利新蓝溶液

精密称取15.00 mL的H3PO4溶液和2.00 mL的 H2SO4溶液，然后在两种溶液中加入100 mL的蒸馏水，充分震荡将其混合均匀，得到混合溶液。将pH调为1，将0.11 g的阿利新蓝中加入到量取出来的适量混合溶液中，即配制成阿利新蓝染色液，置冰箱中用于糖胺聚糖的测定。

2.3.2  标准曲线的制备

精密称取0.10 g的硫酸软骨素对照品置100 mL的容量瓶中，用蒸馏水定容，分别量取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL的对照品溶液，将6个容量瓶中分别加入15 mL 2.3.1配好的阿利新蓝溶液，即得标准溶液，将其静置10 min，在 可见分光光度计490 nm处测定对照品的吸光度。设置横坐标为对照品溶液的浓度，纵坐标为测定的吸光度，根据横纵坐标绘制标准曲线，得到C为对照品浓度，A为吸光度的回归方程。A=1.057 2C+0.0201（r=0.999 3）。

2.3.3 样品含量的测定

根据“2.3.2”项下标准曲线的制备方法，精密量取野生全蝎和家养全蝎水提液各1 mL，测定样品中糖胺聚糖的含量，依照标准曲线计算样品中糖胺聚糖含量。

2.4  醇提物測定[8]

称定供试品约2～4 g（精密称定），置250 mL锥形瓶中，精密加50% 的乙醇100 mL，密塞，称定质量，静置1 h， 连接回流冷凝管，加热沸腾，保持微沸1 h，冷却至室温，取锥形瓶密塞称质量，用水补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取滤液22 mL，置于干燥后的蒸发皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥3 h，干燥器中冷却30 min，迅速精密测定质量。

2.5  抗病毒作用测定[9]

2.5.1  MA104细胞的培养

将冻存的MA104细胞从超低温冰箱中取出，迅速放到已经加温至37 ℃的蒸馏水中，等到冻存液溶化后，转移至2 mL EP管中，用离心机在1 000 r/min离心三分钟，吸去冻存液，将管底的细胞用10%胎牛血清的1640将细胞吹散均匀，转移至培养瓶中，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养，备用。

2.5.2  药物对细胞毒性的测定

将生长对数期的MA104细胞消化，以1×105的密度接种于96孔板中，在37 ℃ 5% CO2孵育过夜，待细胞长至90%后，吸去培养基，将两种全蝎水提液分别二倍稀释九个浓度，接种至细胞中，设4个复孔，设置细胞对照及阳性对照，置培养箱培养24 h后，每孔加入20 ?L MTT，在培养箱避光培养4 h后，每孔加入100 ?L DMSO，预留出4个空白对照孔，用酶标仪在492 nm处测定OD值，计算野生全蝎和家养全蝎对细胞的最大无毒浓度，以便接下来的体外抗病毒实验。

细胞抑制率=[1-（给药组平均OD值-校准组平均OD值）/（细胞对照组平均OD值-校准组平均OD值）]×100%

2.5.3  体外抗病毒测定

将两种全蝎水提液从最大无毒浓度起用含2%胎牛血清的1640培养基维持液从最大无毒浓度起依次二倍稀释，每孔50 ?L接种于MA104已长至90%的96孔板中，然后每孔加入50 ?L 100倍TCID50浓度的病毒液，设置细胞对照，病毒对照，利巴韦林阳性对照，设置4个复孔。在37 ℃ 5% CO2培养箱中培养，待病毒对照病变达到80 % 时，每孔加入20 ?L MTT，置培养箱作用4 h，吸去培养基，每孔加入100 ?L DMSO，预留4个空白校准孔。用酶标仪在与2.5.2下同样的波长下测得细胞OD值，根据OD值计算出加药后细胞的存活率。

细胞存活率=[（给药组平均OD值-校准组平均OD值）/（细胞对照组平均OD值-校准组平均OD值）]×100%

3  实验结果

3.1  蛋白质含量比较

对所得数据进行t检验，得t =2.076， P>0.05，说明野生与养殖全蝎中蛋白质的含量无显著性差异，结果见表1。

3.2  糖胺聚糖含量比较

对所得数据进行t检验，得t=1.127， P>0.05，根据P值以及野生全蝎和家养全蝎的含量测定结果可以说明两者糖胺聚糖的含量不存在明显的差异，结果见表2。

3.3  醇提物颜色及含量比较

对于野生全蝎与养殖全蝎醇提物观察，两者随颜色存在差异，但对三次测定的醇提物含量平均值并无太大差异，养殖全蝎略大于野生全蝎。实验结果见表3。

3.4  抗病毒作用對比

对两组全蝎水提液冻干后，进行抗病毒作用对比，可以得知养殖全蝎冻干粉水提取液对以下三种病毒的抑制抑制作用整体上优于野生全蝎。其中，抗HSV效果差异较显著，结果见图1-3。

4  讨 论

通过对野生全蝎和家养全蝎水提液蛋白、糖胺聚糖含量的测定，以及对其醇提物颜色和提取量的比较，可以得知野生全蝎和家养全蝎蛋白、糖胺聚糖含量以及醇提率都没有明显的差异，这与两者酶解液中的结论是一致的。两者醇提物比较中虽颜色有差别，但含量并无统计学上的意义。

在抗病毒作用比较中，对HSV病毒的抑制率，在高浓度条件下（>0.07 mg·mL-1）养殖全蝎明显高于野生全蝎，具有显著性的差异。在抗RSV中只有0.13 mg/kg时具有显著性的差异，其他浓度均无差异。在EV71病毒中两者在高浓度区（1 mg·mL-1）具有显著性的差异。

综合分析，养殖全蝎整体上优于野生全蝎，可能是由于养殖全蝎的生长环境和饲养条件更为优越，导致养殖全蝎中有效成分含量多于野生全蝎，致使其药效高于野生全蝎。经过系列比较野生与养殖全蝎在牛黄酸含量、酶解液抗肿瘤活性以及水提液抗病毒活性等方面的差异，可以初步确定用养殖全蝎代替野生全蝎是可行的，这对于保护生态环境和生物多样性，提高全蝎临床效果，发展动物药养殖经济具有重大的现实意义。

参考文献：

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[4]王舒玉， 曹广超， 林伟江， 高世杰， 王集会. 正交试验法优化发酵蜣螂粉中水溶性蛋白的提取工艺[J]. 当代化工， 2018， 47 （11）： 2334-2337.

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