CRE对多粘菌素B的敏感性及两种检测方法的差异

李焕芹，牛 敏，刘淑敏，宋贵波，杜 艳

(昆明医科大学第一附属医院检验科 云南省检验医学重点实验室 云南省实验诊断研究所，云南 昆明 650032)

耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE)已成为医院获得性感染的重要病原体，感染者病死率高，疾病负担重，治疗方案有限，且菌株可通过质粒、整合子和插入序列等水平播散，给临床抗感染治疗带来极大的挑战[1-3]。多粘菌素B是一种环状多肽抗生素，于1947年发现，主要是多粘菌素B和E，其带正电荷性质，与革兰阴性菌菌膜上带负电荷的磷酸基团结合，导致脂多糖(LPS)不稳定，改变菌膜的渗透性，同时还能抑制重要的还原酶(如菌膜中的II型NADH醌氧化还原酶)，从而发挥抗菌作用[4-7]。多粘菌素被广泛用于治疗革兰阴性杆菌引起的严重感染，直到二十世纪八十年代，因其肾毒性和神经毒性被逐渐停用，但由于CRE菌株抗感染缺乏新的有效抗菌药物，导致多粘菌素被重新引入临床抗感染治疗中[8-10]，随着多粘菌素B的大量使用，世界范围内对多粘菌素B耐药的鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌相继出现并逐年增多[11-12]。鉴于临床上CRE菌株对多粘菌素B体外敏感性检测相关的临床研究较少，临床经验有限，迫切需要快速、准确的药敏结果指导临床合理用药。

最低抑菌浓度(MIC)是极有价值的药物敏感性试验数值，为临床制定合理用药方案、调整用药方案及实施个性化用药提供依据[13]。临床上测定MIC值的方法有琼脂稀释法、微量肉汤稀释(broth mirodilution，BMD)法、E-test法以及自动化分析仪法，其中E-test法是一种简便且可测定各种微生物(包括苛养菌)体外药物敏感性的替代方法，但因其在多粘菌素B敏感性测定方法中的应用不同导致研究结果不同，研究[14-16]表明其与BMD法在MIC值上保持一致，也有研究[17]报道因药物在琼脂中扩散不均，其结果并不十分可靠。本研究收集昆明医科大学第一附属医院2018年1—12月分离于临床各科室患者的非重复CRE菌株230株，通过比较E-test法与BMD法检测CRE菌株对多粘菌素B的敏感性差异，评估E-test法的临床应用效果，为临床用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集2018年1—12月昆明医科大学第一附属医院临床各科室送检的非重复CRE菌株230株，药敏质控菌株大肠埃希菌ATCC 25922购自卫生部临床检验中心。

1.2 仪器与试剂 全自动微生物鉴定与药敏分析系统VITEK 2和配套的GN卡、AST-GN14卡均购于法国生物梅里埃公司。插入式多粘菌素B药敏试纸条(E-test法)、多粘菌素B药敏试剂板条(BMD法)、药敏接种培养液均由温州市康泰生物科技有限公司提供；MH琼脂平板购自郑州安图生物工程股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 药敏试验 采用插入式E-test试纸条法和微量肉汤稀释法进行MIC值检测，严格按照产品使用说明书两种方法同时进行，两名专业人员同时读取数据。

1.3.2 药敏试验结果判断 参照2018年欧洲临床微生物和感染病学会药敏委员会(EUCAST)折点判断[18]，质控菌株ATCC 25922 MIC值范围在(0.25～2)μg/mL表明在质控范围内。试验菌株MIC≤2 μg/mL判定为敏感(S)，MIC>2 μg/mL判定为耐药(R)。

1.4 数据分析 MIC值定义为在琼脂或肉汤稀释法药物敏感性检测试验中能抑制肉眼可见的微生物生长的最低抗菌药物浓度；以BMD法为标准，基本一致性(essential agreement，EA)：待测MIC系统与参考方法MIC值相差不超过1个稀释倍数；分类一致性(categorical agreement，CA)：被评估药敏方法与参考方法判断试验结果为敏感、中介、耐药的一致性；极重大误差 (very major error，VME)：将耐药误判为敏感，即假敏感；重大误差(major error，ME)：将敏感误判为耐药，即假耐药；小误差(minor error；mE)：将中介判为敏感或耐药、或者将耐药或敏感判为中介[5]。根据美国临床实验室标准化协会(CLSI)要求，能接受的误差范围CA和EA均≥90%，VME≤1.5%，ME<3%，mE≤10%[19]。

2 结果

2.1 E-test法和BMD法测定质控菌株大肠埃希菌的MIC值 E-test法检测质控菌株ATCC 25922对多粘菌素B的MIC为0.5 μg/mL，BMD法测定的MIC为0.25 μg/mL，均在质控范围内(0.25～2 μg/mL)。

2.2 标本来源及病原菌分布特点 标本来源以痰为主(163株)，占70.87%，其次是血(33株，14.35%)和分泌物(15株，6.52%)；尿、引流液、脑脊液分别占3.48%、3.04%、1.74%。病原菌分布以肺炎克雷伯菌为主(205株)，其次为阴沟肠杆菌(14株)和大肠埃希菌(7株)。

2.3 两种方法测定菌株对多粘菌素B的药敏结果

2.3.1 两种药敏试验方法检测CRE对多粘菌素B敏感性的差异 通过比较E-test法和BMD法，E-test法敏感率较高，为96.52%，BMD法耐药率较高，占4.35%，见表1。

表1两种药敏试验方法检测230株CRE对多粘菌素B药敏结果[株(%)]

Table1Susceptibility testing result of 230 strains of CRE to polymyxin B detected by two antimicrobial susceptibility testing methods (No. of isolates[%])

药敏试验方法敏感耐药E-test法222(96.52)8(3.48)BMD法220(95.65)10(4.35)

2.3.2 两种药敏试验方法比较CRE对多粘菌素B的MIC值变化 经E-test法测得多粘菌素B的MIC50、MIC90均为0.5 μg/mL，BMD法对多粘菌素B的MIC50、MIC90为0.5、1 μg/ mL，MIC90值E-test法的MIC较BMD法低1个稀释度，药敏试验方法的误差统计学分析以BMD法为参考方法，两种方法基本一致率95.65%，分类一致率99.13%，mE 0，ME 0，VME 0.87%。见表2、图1。

表2E-test法和BMD法检测CRE对多粘菌素B的MIC比较(μg/mL)

Table2Comparison in minimum inhibitory concentrations of CRE to polymyxin B detected by E-test method and BMD method(μg/mL)

药敏方法MIC范围MIC50MIC90E-test法0.125～128 0.50.5BMD法0.25～128 0.51.0

3 讨论

CHINE细菌耐药监测数据显示，近年来CRE菌株呈逐年增长趋势，尤其是肺炎克雷伯菌，多粘菌素耐药的CRE菌株引起的感染治疗选择极其有限且病死率高，本研究中CRE菌株对多粘菌素耐药仅3.48%和4.35%，与国内其他医院耐药率4.4%相近[20]，耐药率尚低，两种方法MIC50均为0.5 μg/mL，MIC90分别为0.5、1 μg/mL，E-test法最低MIC值为0.125 μg/mL，BMD法最低MIC值为0.25 μg/mL，E-test法的敏感率为96.52%，BMD法的敏感率为95.65%，表明多粘菌素B对CRE菌株有很好的抗菌活性，故在临床CRE抗感染治疗中，可经验性选择使用。

注：散点图结果是将E-test法确定的多粘菌素MIC值(横坐标)与BMD确定的MIC值(纵坐标)进行比较。对角黑线表示完全一致，数字代表在每个点观察到的事件，虚线表示测试结果之间相差一个稀释度的MIC值。水平和垂直虚线表示耐药折点(>2 μg/mL)

图1E-test法与BMD确定的MIC散点图

Figure1Scatter diagram of minimum inhibitory concentrations determined by E-test method and BMD method

多粘菌素B的体外药敏试验存在诸多挑战，缺乏可靠的药敏试验参考方法，多粘菌素存在多组分构成问题，在琼脂中扩散不良，还有其阳离子的吸附性质、异抗性的出现及培养基贮藏的影响等[11]，故目前对多粘菌素敏感性试验方法还未在国际上达成共识。EUCAST推荐使用BMD法测定多粘菌素的MIC值，并制定了粘菌素药敏结果的折点判读标准。目前多粘菌素B体外敏感性试验可采用琼脂扩散法、BMD法、E-test法和自动化分析法检测，研究[21]表明琼脂扩散法与BMD法一致性良好，但两种方法均操作复杂，不适合临床实验室常规实施；另一个问题是多粘菌素B容易吸附到聚苯乙烯中，本次试验菌株有127株BMD测定的MIC值较E-test高1个稀释度，考虑该试验结果出现原因为多粘菌素B对塑料的吸附导致在微孔中分配的药物实际浓度低于标准浓度。E-test法是近年来研究的新型方法，以其操作简便、结果可靠的优势已被越来越多应用于苛养菌、真菌以及多重耐药菌MIC值的测定，本试验使用的药敏纸条又称为梳齿状药敏试纸条，为插入式E-test试纸条，是我国自主设计、专利生产的梯度浓度药敏试条，通过将含有黏附作用的缓释剂将抗菌药物附着在梳状药敏试条的梳齿下部，结合了稀释法和扩散法的原理和特点，定量检测细菌对药物的敏感性，插入式E-test试纸条不会产生平放式E-test试纸条会产生的气泡等干扰因素，插入琼脂后近乎一条直线，在读取抑菌圈椭圆的边与试纸条相交点时更直观，在操作上更简便[22]。本试验结果显示E-test法和BMD的基本一致率为95.65%，分类一致率高达99.13%，与各项研究结果显示E-test法和参考方法BMD之间存在良好的相关性一致[14]，故临床实验室可考虑采用E-test法进行多粘菌素B的常规敏感性检测。

本研究有3株CRE敏感菌株，BMD法出现了跳孔现象，3株前后孔表现一致，查阅相关文献，导致此现象的原因可能是污染，以及多粘菌素B异质性耐药的出现[23]。异质性耐药是指在体外药敏试验中，发现细菌的大部分亚群属于敏感，但有一小部分亚群出现耐药，作为一种独特的耐药现象，已经成为抗菌治疗的新挑战。针对多粘菌素B的异质性耐药问题，可以通过加大剂量和联合用药来解决异质性耐药的问题，达到临床治疗效果。本研究中VME为0.87%，CLSI能接受的误差范围为VME≤1.5%，仍在可控范围内。分析出现“假敏感”现象的原因可能是人员操作差异，避免此类误差的方法是规范操作。本次试验BMD法检测出10株耐药菌株，其中2株与E-test结果不符，其原因尚不明。

综上所述，CRE对多粘菌素B有较好的抗菌活性，是抗感染治疗的重要药物，BMD法目前是检测多粘菌素B体外药物敏感性的推荐方法，但是其操作较为繁琐且对药物及培养基要求较高，本研究表明E-test法和BMD法在0.25～1 μg/mL时一致性良好，试验中使用的垂直插入式E-test试纸条较传统的E-test平放试纸条有一定优势，一定程度上解决了药物在琼脂中难扩散及多粘菌素B对塑料的吸附问题的缺点，E-test法操作简便，和BMD法一致性好，可以应用于临床常规药敏试验，同时BMD法需规范试剂厂家生产规格。