血红栓菌液体发酵产漆酶培养条件的研究*

郭金英，赵翠敏，张云龙，王宁宁，郑素月

（河北工程大学园林与生态工程学院，河北 邯郸 056021）

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶[1]，主要分布于真菌和植物中，在空气中也可以保持活性。按其来源可分为漆树漆酶和真菌漆酶。1883年，日本学者Yoshida[2]首次从日本紫胶漆树（Rhus vernicifera） 中发现漆酶，Mayer[3]研究发现漆酶广泛分布于真菌（尤其是白腐真菌）、植物和昆虫等真核生物中。漆酶作为一种绿色生物催化剂，在食品、环保、造纸、检测等多个领域具有巨大的应用潜力[4-6]。近年来许多学者对产漆酶的菌类进行了培养条件优化的研究，如甄静等[7]通过试验对毛栓孔菌（Trametes hirsuta） XYG422发酵培养基及培养条件进行优化筛选，得出XYG422最适宜碳氮源分别为玉米粉和酒石酸铵；韩美玲等[8]以2株糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus） 为材料，研究培养基在添加木屑、玉米芯和棉籽壳后对其产漆酶影响，结果表明，棉籽壳对不同糙皮侧耳菌株产漆酶能力的诱导作用更强。刘苹等[9]在金针菇（Flammulina velutiper） LP03液体培养过程中，考察了培养基组成以及培养条件对漆酶分泌的影响；芦红云等[10]研究了天麻（Gastrodia elata） 提取物及单一成分天麻素、对羟基苯甲醛、对轻基苯甲醇均对灰树花（Grifola frondosa）菌丝体和胞外漆酶活性有显著的促进作用。血红栓菌（Trametes sanguinea） 别名红栓菌小孔变种、朱血菌，是多孔菌科（Polyporaceae） 密孔菌属（Pycnoporus）的一种，属白腐真菌。血红栓菌经济用途广泛，药用价值显著，引起越来越多的人对其进行开发利用[11-12]。本试验中以血红栓菌为研究对象，采用液体培养，考察碳源、氮源、金属离子及其他培养条件对血红栓菌漆酶分泌的影响，旨在优化培养条件，提高血红栓菌产漆酶能力，为工业应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与培养基

血红栓菌菌株由河北工程大学微生物实验室保存。

固体PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉 17 g、KH2PO43.0 g、MgSO41.5 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然；种子培养基：马铃薯200 g、葡萄糖 20 g、蛋白胨 3 g、KH2PO43.0 g、MgSO41.5 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然；基础产酶培养基：葡萄糖 30 g、蛋白胨 4 g、KH2PO43.0 g、MgSO41.5 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种的活化

在无菌条件下，将保藏的菌株转接至固体PDA培养基，25°C下培养7 d备用。

1.2.2 种子液培养

300 mL三角瓶中加入100 mL种子培养基灭菌，接入研磨后的菌丝，置于恒温振荡培养箱，25°C、130 r·min-1条件下培养 4 d。

1.2.3 基础产酶培养基培养

300 mL三角瓶中加入100 mL产酶培养基灭菌，种子液接种量为4%，置于恒温振荡培养箱，25°C、130 r·min-1条件下培养 6 d。

1.2.4 酶液的制备

将发酵液转移至离心管中，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液即为粗酶液样品。

称取菌丝体0.1 g，加入1 mL生理盐水，研磨至组织破碎后，4℃浸提3 h，12 000 r·min-1离心10 min，取上清，即为菌丝体酶液样品。

1.2.5 漆酶活力测定

称取ABTS 10 mg，加入乙酸150 μL，用去离子水定容到30 mL，所得溶液作为反应底物，避光储存于 4℃冰箱待用。取 1.2.4中制备的粗酶液 40 μL加入上述的反应底物760 μL，37℃反应 5 min后，在波长420 nm处测量3 min内吸收值，同时测定灭活酶液吸光值作为对照[12]。酶活单位定义为每分钟氧化1 μmol底物所需的酶量为一个酶活力单位（U·mL-1），漆酶活力（E，U·mL-1）计算公式如下：

式中：△t为酶反应时间（min）；△OD为吸光度的变化值；V1为酶反应中反应液的总体积（mL）；V2为酶反应中，酶液的总体积（mL）；N为酶液稀释倍数。

1.2.6 血红栓菌在基础产酶培养基中产酶时间

为研究血红栓菌产酶时间历程，将种子培养基接入产酶培养基后置于恒温振荡培养箱中培养，从第3天开始，每天在无菌条件下取样测定漆酶活力，一共测10 d，每次试验3个重复。

1.2.7 培养基的优化

分别以蔗糖 30 g·L-1、麦芽糖 30 g·L-1、甘露醇30 g·L-1、葡萄糖 15 g·L-1和蔗糖 15 g·L-1、葡萄糖15 g·L-1和淀粉 15 g·L-1作为产酶培养基中的碳源，比较碳源的影响；分别以酵母膏4 g·L-1、硫酸铵 4 g·L-1、硝酸铵 4 g·L-1、蛋白胨 2 g·L-1和硝酸铵 2 g·L-1、硝酸铵 2 g·L-1和蛋白胨 2 g·L-1作为产酶培养基中的氮源，比较氮源的影响；于产酶培养基中分别添加CuSO4溶液、NaCl溶液、KCl溶液和MnSO4溶液使以上金属离子终浓度达到1.5 mmol·L-1，比较金属离子的影响。

接种量为4%，置于恒温振荡培养箱中25°C、130 r·min-1条件下培养6 d。每个处理3个重复。

1.2.8 培养条件的优化

在优化培养基的基础上，对产漆酶的发酵条件（温度、初始pH、接种量、装液量）进行优化，采用L16（45）正交试验，以漆酶活力作为试验指标，分别测定不同培养条件对血红栓菌产漆酶的影响。

2 结果与分析

2.1 血红栓菌在基础产酶培养基上产酶时间研究

对菌种在基础产酶培养基上产酶时间历程进行研究，每天定量取漆酶样品进行测定，结果见图1。

图1 血红栓菌在基础产酶培养基上产酶历程Fig.1 Enzyme production process time of Trametes sanguinea in the basal enzyme culture medium

由图1可知，发酵液在培养的前3 d，漆酶含量很低，测不到活力；第3天到第6天，漆酶活力呈上升趋势，在第6天达到最高峰，为53.8 U·mL-1；随后酶活力逐渐降低。因此，确定产漆酶的最适时间为6 d。

2.2 不同碳源对血红栓菌产漆酶的影

对培养基组成成分中的碳源进行研究，以不同碳源替代基础产酶培养基中的葡萄糖，其中组合碳源的比例为1∶1进行试验，考察其对产酶的影响，结果见图2。

图2 不同碳源对漆酶活力的影响Fig.2 Effects of different carbon sources on laccase activity

由图2可知，以蔗糖和葡萄糖组合作为碳源的处理酶活最高，达61.48 U·mL-1；葡萄糖其次，为56.54 U·mL-1。因此，蔗糖 15 g·L-1和葡萄糖 15 g·L-1的组合碳源为产漆酶最适碳源。

2.3 不同氮源对产漆酶的影响

考察不同氮源对血红栓菌产漆酶的影响，以不同氮源替代基础产酶培养基中的蛋白胨，结果见图3。

图3 不同氮源对漆酶活力的影响Fig.3 Effects of different nitrogen sources on laccase activity

由图3可知，以硝酸铵和蛋白胨组合作为氮源的处理漆酶活力最高，达83.15 U·mL-1；硫酸铵次之。因此确定硝酸铵和蛋白胨组合为最佳氮源成分。

2.4 不同金属离子对产漆酶的影响

在产酶培养基中添加1.5 mmol·L-1的不同种类的金属离子，研究不同金属离子对菌种产漆酶活性的影响，结果见图4。

图4 不同金属离子对漆酶活力的影响Fig.4 Effects of different metal ions on laccase activity

由图4可知，CuSO4对漆酶合成的促进作用最大，酶活达到 106.42 U·mL-1；其次为 KCl，达 97.53 U·mL-1；NaCl对发酵液漆酶酶活也起到了促进作用；而MnSO4对漆酶的合成有一定的抑制作用，比对照的酶活下降 6.29 U·mL-1。

2.5 培养基优化正交试验

在单因素试验的基础上，应用正交试验法对血红栓菌液体培养基的3个因素（碳源、氮源、金属离子）在3个水平上进行L9（34）正交试验，测定发酵液漆酶酶活。每组设3个重复，取平均值。试验因素水平见表1，正交试验结果见表2。

表1 正交试验因素水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal design

由表 2 可知，T=826.14，极差 C＞B＞A，说明因素C（金属离子） 对血红栓菌胞外漆酶活力的影响最大，是主要的影响因素，因素B（氮源）的影响次之，因素A（碳源）的影响最小。通过比较3个因素的K值，可以得出最优组合为A2B2C3，发酵液酶活为129.32 U·mL-1。因此，通过单因素试验与正交试验设计，筛选出血红栓菌发酵产漆酶最优条件为葡萄糖 15 g·L-1、蔗糖 15 g·L-1、蛋白胨 2 g·L-1、硝酸铵 2 g·L-1、CuSO42 mmol·L-1。

表2 培养基正交试验结果Tab.2 Results of orthogonal test of culture medium

2.6 培养条件正交试验

在优化后培养基的基础上，对产漆酶的发酵条件（温度、初始pH、接种量、装液量）进行优化，采用L16（45）正交试验，因素水平表见表3，试验结果见表4。

表3 正交试验因素水平表Tab.3 Factors and levels of orthogonal design

由表4可知，T=1 609.26，在血红栓菌发酵液中，极差B＞A＞C＞D，说明培养条件中因素B（初始pH）对血红栓菌胞外漆酶活力影响最大，是主要的影响因素；因素A（温度）影响次之；因素C（接种量）及因素D（装液量）影响较小。根据极差分析结果来看，最优组合为A3B2C4D3，酶活达165.19 U·mL-1。因此，液体培养最佳发酵条件为温度为28℃，初始pH 5，接种量8%，装液量为100 mL。

表4 培养条件正交试验结果Tab.4 Results of orthogonal test of culture conditions

3 结论

在血红栓菌液体培养过程中，考察了血红栓菌产酶时间历程及培养基组成对漆酶分泌的影响。通过单因素试验和正交试验对血红栓菌产漆酶液体培养基进行优化，对培养条件（温度、接种量、装液量、pH）4个因素进行正交试验。结果显示，以葡萄糖15 g·L-1、蔗糖 15 g·L-1为碳源，以蛋白胨 2 g·L-1、硝酸铵 2 g·L-1为氮源， CuSO42 mmol·L-1，培养温度为28℃，初始pH 5，接种量8%，装液量100 mL为最优培养条件。在此条件下培养的血红栓菌，漆酶酶活力高，菌丝生长较快。

通过试验，发现在液体发酵产漆酶的条件中，适宜的金属离子添加量为2 mmol·L-1，这与司静等[14]研究的栓孔菌属和王志新[15]研究的血红密孔菌发酵产漆酶的研究结果一致。本研究中供试菌株最适pH为5，与刘新颖等[16]研究的双孢蘑菇结果一致，与司静等[14]研究中最适产酶pH为4.8结果基本一致。本研究中供试菌株最适温度为28℃，与司静等[14]研究结果相一致。