金钱鱼鳃细胞系的建立及其生长特性的初步研究

2019-12-03周佳楠苏冒亮张俊彬

热带海洋学报 2019年6期

周佳楠, 苏冒亮, 张俊彬,2

海洋生物学

周佳楠1, 苏冒亮2, 3, 张俊彬1,2

1.上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心, 上海 201306;2. 深圳市海洋生物资源与生态环境科学重点实验室, 深圳大学生命科学与海洋学院, 广东深圳 518060; 3.光电子器件与系统教育部和广东省重点实验室, 深圳大学光电工程学院, 广东深圳 518060

鳃是鱼类渗透压调节的主要器官, 鳃细胞的培养技术的建立可以为鱼类渗透压调节机理研究提供重要的实验手段和研究方法。金钱鱼()作为一种广盐性鱼类, 是研究渗透压调节机制的理想动物模型。本研究采用胰蛋白酶消化法进行了金钱鱼鳃细胞的体外培养, 确定该类细胞原代和传代培养的最优条件, 分析了其生长特性。结果表明, 金钱鱼鳃细胞系在28℃, 含有20%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的L-15培养基中生长最佳, 2~4d即可传代, 传代后可稳定培养, 命名为SG。在传代培养过程中, 对其增殖情况进行分析, 发现SG细胞群体倍增时间为40.8h。正常传代的SG细胞冻存、复苏后, 经台盼蓝染色测得细胞存活率约为87%。鳃细胞直接同水体环境接触, 具有高效的渗透压调节能力。环境盐度变化时, 鳃细胞启动渗透压胁迫应答机制, 维持内环境稳态。本研究对SG细胞进行渗透压刺激后, 检测其增殖情况并观察形态变化。分析表明, SG细胞在分别为150和600mOsmol·kg–1的低渗和高渗胁迫后均可增殖, 且低渗胁迫后的增殖速度是高渗胁迫的1.5倍。渗透压胁迫后SG细胞的形态观察结果显示, 低渗培养基胁迫后细胞体积发生膨胀而高渗条件下细胞体积发生皱缩。由此推断SG细胞具有较强渗透压耐受性, 且低渗耐受能力强于高渗。SG细胞系的建立为金钱鱼渗透压应答机制和相关基因功能的研究提供了基础实验材料。

金钱鱼; 鳃细胞系; 原代培养; 传代培养

与哺乳动物细胞相比, 鱼类细胞不需要频繁的传代以保持细胞活力, 且具有耐温范围广、取材广泛等特点(张博等, 2011), 被广泛用于免疫学、内分泌学和功能基因组学等研究(Laing et al, 2011; Skrzypski et al, 2016; 张永德等, 2018)。近年来, 以鱼类细胞为实验对象的研究发展迅速, 主要涉及肾脏、肝脏等组织的细胞系(Lai et al, 2003; 樊廷俊等, 2010; Abdul Majeed et al, 2013; Xue et al, 2018)。鱼鳃细胞具有较强的有丝分裂能力, 并不会受鱼体成年的影响, 是细胞培养的良好材料(张博等, 2011)。鳃细胞直接同水体环境接触, 当水体盐度发生变化时, 鳃细胞是参与渗透压调节, 维持体内稳态的主要细胞类型。有研究者将虹鳟()鳃原代细胞暴露在低渗环境中, 发现鳃细胞可以通过调节自我体积以维持内环境稳态(McCarty et al, 1992; Leguen et al, 1998; Wehner et al, 2003)。鳃细胞是鱼体内参与渗透压调控的主要功能细胞, 鳃细胞系的建立可有助于从细胞水平上更清楚的了解鱼类的渗透压胁迫应答机制。但由于鱼类的鳃细胞直接暴露于水生环境中, 鳃表面有细菌等污染物, 因此, 鳃细胞系的建立有一定的技术难度。

鱼类细胞分离常用的方法有胰蛋白酶消化法和组织块迁出法。组织块迁出法分离到的细胞完整性较好, 但细胞迁出时间较长。胰蛋白酶消化法操作简单, 获得细胞量较多, 细胞增殖速度也较组织块迁出法更快(王彬等, 2010)。细胞迁出后需足够的营养物质和适宜的培养条件才可正常贴壁和生长。胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)中的活性蛋白和一些未知因子是维持细胞生长的重要物质(王梦珣等, 2018)。在细胞培养中, 温度也是影响其生长和增殖的主要环境因子, 培养温度的变化可能会影响细胞代谢等生理活动从而导致细胞增殖速度发生变化。已报道的通过胰蛋白酶消化法和组织块迁出法获得细胞并传代培养的鱼类细胞系有非洲鲶鱼()卵巢细胞系(Kumar et al, 2001)、虹鳟()皮肤细胞系(Ossum et al, 2004)、石斑鱼()脑细胞系(Ku et al, 2009)以及金钱鱼()肾脏细胞系(张莹莹等, 2014)等。

金钱鱼隶属于鲈形目Perciformes, 金钱鱼科Scatophagidae, 金钱鱼属, 主要分布于印度—太平洋海域。在我国, 金钱鱼主要分布于东南沿海, 是一种优质海水鱼养殖品种, 具有较强的渗透压调节能力, 是研究渗透压调节机制的良好模型(Su et al, 2016)。本研究旨在建立金钱鱼鳃细胞系, 确定其最适培养条件及生长特性, 为金钱鱼渗透压胁迫应答机制和基因功能等的研究提供平行性好、可精准控制条件的实验材料。

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂

金钱鱼(体重为40.6±3.4g)购自广东省湛江市, 于25‰盐度的循环水养殖系统中暂养4周, 水温维持在28±1℃。早晚各投喂一次, 实验开始前两天停止喂食。L-15培养基(Leibovitz's L-15 Medium, L-15)和0.25%胰酶-EDTA购自Thermo Scientific公司; 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)购自Gibco BRL公司; 双抗(青霉素、链霉素)、二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)购自Sigma公司。胶回收试剂盒购自Takara公司, pGEM-T Easy载体购自Promega公司, Cell Counting Kit-8/CCK8细胞增殖检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养基的配制

原代培养基为含20%FBS和400U双抗的L-15培养基, 传代培养使用含10%FBS的L-15培养基。配制低渗(150mOsmol·kg–1)、等渗(300mOsmol·kg–1)和高渗(600mOsmol·kg–1)培养基。具体方法为, 在L-15培养基中加入无菌饱和NaCl和ddH2O, 测定培养基渗透压(误差＜2mOsmol·kg–1)最后加入终浓度为10%的FBS, 备用。

1.2.2 原代培养与传代培养

取一尾状态良好的金钱鱼, 先将整尾鱼放入75%酒精中浸泡30s、抽血后无菌解剖取出鳃组织, 用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS)冲洗鳃组织5次后75%酒精冲洗1次, 再用含400U双抗的PBS冲洗7~8次。去除残留血液。将鳃组织剪碎至1mm3大小, 放入15mL离心管中, 加入0.25%胰酶-EDTA于28℃培养箱中消化30min后终止消化。经200目筛网过滤, 获得的细胞悬液1000×g室温离心10min, 弃上清。加入培养基悬浮细胞沉淀, 接种至25cm2培养瓶, 28℃培养。细胞贴壁后逐步更换培养基, 梯度降低双抗浓度, 细胞长至90%时, 完全去除双抗。

细胞铺满瓶底后, 弃培养基加入500μL 0.25%胰酶-EDTA消化细胞, 待细胞脱壁后, 加入20%FBS的L-15终止消化。吹打混匀细胞, 1︰2或1︰3比例传代培养。

1.2.3 最适体外培养条件的确定

为确定鳃细胞体外培养的最适FBS浓度, 取第9代鳃细胞, 胰酶消化后经血球计数板计数。按照CCK-8说明书, 细胞以5000cells·100μL–1的密度接种到96孔细胞培养板中。共接种5块板, 每板6组, 每组5个复孔, 一个空白对照。待细胞贴壁后以板为单位弃去原培养基分别更换为含0、5%、10%、15%、20%和25%FBS的L-15培养基, 28℃继续培养。每天每个浓度各选一组细胞加入10μL CCK-8, 孵育24h后, Synergy H4全功能酶标仪(Bio-Tek)检测光密度(optical density, OD), 检测波长为450nm。实验连续进行6d。

为确定鳃细胞体外培养的最适温度, 采用上述方法接板。待细胞贴壁后, 分别放到温度为20、24、28、32和36℃培养箱中继续培养。每天取每块板的一组加入10μL CCK-8, 孵育24h后, 检测光密度(方法同上)。实验连续进行6d。

1.2.4 细胞系的生长曲线绘制

细胞接板方法同上, 待细胞贴壁后以板为单位弃去原培养基更换为含20% FBS的L-15培养基, 28℃继续培养。每天取一组加入10μL CCK-8, 孵育24h后, 酶标仪450nm处检测光密度, 实验连续进行7d。根据公式=×lg2/lg(N/N0), 计算细胞系的群体倍增时间(), 其中0为起始接种的细胞数,N为培养时间后的细胞数(Fan et al, 2007)。

1.2.5 细胞系的分子生物学鉴定

采用TRIzol法提取细胞总RNA。加1mL Trizol冰上裂解细胞5min, 加入200μL氯仿异戊醇, 剧烈摇晃30s后静置2min, 离心。取上清液, 1:1加入异丙醇, 混匀后静置10min, 离心弃去上清。用1mL 75%酒精清洗沉淀的RNA, 弃去酒精, 无菌风吹干沉淀, 加DEPC水溶解RNA。通过琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 2000(Thermo Scientific)进行RNA完整性和浓度、纯度的测定。取1μg RNA, 以Oligo d(T)16作为接头引物进行反转录, –20℃保存产物。

普通PCR扩增金钱鱼鳃细胞和鳃组织18S rRNA基因。转录组数据库中获取18S rRNA基因序列。利用Premier 5.0设计引物, 由生工生物工程(上海)合成。引物序列见表1。扩增体系(50μL): (NH4)2SO4Buffer 5μL, Mg2+5μL, dNTP(10mmol·L–1) 2μL, cDNA 2μL, 引物(10pmol)各1μL, Taq酶0.6μL, ddH2O 33.4μL。反应程序: 95℃预变性2min, 94℃变性35s, 55℃退火40s, 35个循环, 72℃延伸1min, 72℃后延伸10min, 4℃保存。利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物, 通过胶回收试剂盒回收目的片段, 连接至pGEM-T Easy载体, 并转化到DH5α感受态细胞中, 挑选单克隆菌落送测(生工生物,上海), 利用NCBI BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)对测序结果进行同源性比对分析, 确定细胞系来源。

表1 引物序列

1.2.6 冻存与复苏

取对数生长期的鳃细胞, 胰蛋白酶消化后加入培养基重悬, 离心弃上清。加入1mL冻存液(冻存液: 20% FBS、10%DMSO和70% L-15培养基)吹打混匀, 转移至冻存管, 放入细胞冻存盒, –80℃冰箱过夜, 液氮中长期保存。

液氮罐中取出冻存的第9代鳃细胞, 迅速放入40±2℃温水中, 融化后将细胞液移入15mL离心管中, 加入10倍体积的L-15培养基, 离心后弃液体, 加入培养基重悬细胞后, 接种至培养瓶。

细胞复苏时, 取少量细胞悬液, 按照细胞悬液: 0.4%台盼蓝以9︰1的比例染色5min, 死细胞将被染成蓝色, 活细胞无色, 血球计数板计数后计算细胞成活率。染色和计数分别重复3次。

1.2.7 金钱鱼鳃细胞渗透压耐受性测定

取第9代鳃细胞, 经血球计数板计数后接板培养。待细胞贴壁后更换低渗、等渗和高渗培养基, 分别孵育5min、10min、30min、1h、3h、6h、12h、24h和48h然后每孔加入10μL CCK-8试剂, 于24h后测定光密度。分析鳃细胞在不同渗透压培养基胁迫后细胞增殖的变化情况。

观察SG细胞在不同渗透压的培养基中培养3h后, 细胞形态的变化。取第9代鳃细胞, 经胰酶消化、培养基重悬后接种到六孔细胞培养板中, 共5组, 每组3个复孔。待SG细胞汇合度达80%时, 弃液体, 加入不同渗透压的培养基, 刺激培养3h后观察细胞形态、拍照。

2 结果

2.1 原代培养及传代培养

本研究采用胰蛋白酶消化法成功分离金钱鱼鳃细胞, 建立细胞体外培养体系。原代培养第6d观察到细胞贴壁(图1a), 第13d细胞铺满培养瓶底面(图1b), 主要为上皮样细胞。SG细胞间存在接触抑制, 无重叠生长。原代培养周期为13d。原代细胞汇合度达到80%即可按照1:1的比例进行首次传代。首次传代后, 细胞增殖速率加快, 5d后可再次进行传代, 10代后传代周期稳定为2~4d。

图1 SG细胞系原代培养

a. 原代培养第6d鳃细胞贴壁; b. 原代培养第13d鳃细胞铺满瓶底

Fig. 1 Primary culture of SG cells. a) Adhesion of branchial cells on the 6th day of primary culture; b) Branchial cells covered with bottle bottom on the 13th day of primary culture.

2.2 最适体外培养条件的确定

对不同FBS浓度培养的SG细胞增殖情况进行分析, 结果表明, 如图2所示SG细胞在FBS浓度为0和25%时细胞均无法增殖; 5%~20%范围内FBS浓度和细胞增殖速度成正比; 20%和5%相比, 每天的增殖速度都要快150%以上, 培养到实验结束(第6d), 20%组是5%组细胞量的200%。因此, SG细胞的最适FBS培养浓度为20%。

图 2 不同FBS浓度对SG细胞生长的影响

分析对不同温度培养的SG细胞的增殖情况发现, 如图3所示, SG细胞的耐温范围较广, 在20~ 36℃范围内均可增殖。32℃和36℃培养细胞时, 细胞增殖较快同时老化也很快, 细胞状态不佳; 细胞在20℃培养6d细胞量仅增加1.3倍, 增殖速度最慢; 24℃时细胞前4d增殖较慢, 4d后增殖速度显著加快, 第6d细胞量增加3倍; 28℃培养的细胞增殖较快, 呈稳定上升趋势且细胞状态较好, 培养第6d细胞数达到最多, 达到了初始接种细胞数的4倍。

图3 不同温度对SG细胞生长的影响

2.3 细胞系的生长曲线绘制

从生长曲线(图4)可以看出, SG细胞贴壁生长的前2d属于细胞生长迟缓期, 2d后进入SG细胞生长的对数生长期, 第4d开始进入平缓期。SG细胞在第6d进入生长的衰退期。SG细胞的群体倍增时间为40.8h。

图4 SG细胞系的生长曲线

Ⅰ: 迟缓期; Ⅱ: 对数生长期; Ⅲ: 平缓期; Ⅳ: 衰退期

Fig. 4 Growth curve of SG cells. Ⅰ: Lag phase; Ⅱ: Logarithmic phase; Ⅲ: Stationary phase; Ⅳ: Decline phase

2.4 细胞系来源鉴定

通过扩增金钱鱼鳃细胞系18S rRNA与金钱鱼鳃组织中18S rRNA基因并比较其同源性来确定细胞系来源。18S rRNA扩增片段长度为819bp, 琼脂糖凝胶电泳结果显示为单一条带。对测序结果比对分析发现序列相似度为99.7%, 确定此细胞系来源于金钱鱼(图5)。

图5 18S rRNA基因的PCR扩增结果

泳道1, Maker为DL2000; 泳道2: SG细胞; 泳道3: 鳃组织

Fig. 5 The result of amplification 18S rRNA.Line 1: Maker: DL2000; Lane 2: SG; Lane 3: gill

2.5 冻存和复苏

复苏冻存的第9代鳃细胞, 通过台盼蓝染色后测得细胞存活率约为87%。细胞复苏后6h贴壁, 4d后铺满培养瓶底部。复苏后细胞形态正常, 传代后细胞生长状态正常。

2.6 不同渗透压刺激后细胞增殖测定

SG细胞在不同渗透压胁迫下的增殖情况如图6所示, SG细胞在低渗和高渗胁迫条件下均可增殖, 低渗胁迫的48h内细胞增殖十分缓慢, 低渗胁迫的前期增殖较慢, 3h后细胞增殖显著加快, 12h增殖最快, 为初始胁迫细胞量的1.5倍。渗透压胁迫后的6h内低渗细胞状态略逊于高渗细胞, 但之后细胞状态显著优于高渗胁迫的细胞。

图 6 不同渗透压条件对SG细胞生长的影响

SG细胞在不同渗透压培养基刺激3h后细胞形态发生明显变化。渗透压为150mOsmol·kg–1的低渗培养基刺激细胞3h后观察细胞形态, 结果表明较正常培养的细胞(图7b), 低渗刺激后SG细胞体积膨胀(图7a)。而渗透压为600mOsmol·kg–1的高渗培养基刺激细胞3h后与对照组相比, SG细胞体积明显皱缩(图7c)。

3 讨论

鱼类细胞培养具有取材广泛、便于观察和检测的优点, 常被用于基因生理功能的体外验证。自草鱼(Duranton et al, 1997)鳃组织中成功分离并建立鳃细胞系后, 牙鲆()(李宏等, 1997)、文昌鱼()(石松林等, 2009)和圆斑星鲽()(樊廷俊等, 2010)等鱼类的鳃细胞系也陆续建立, 但对鳃细胞生长特性的研究较少。本研究成功建立了金钱鱼鳃细胞系, 并确定其最适培养条件和生长特性, 为金钱鱼渗透压胁迫应答机制的研究提供理想实验材料。

图7 不同渗透压刺激后的金钱鱼鳃细胞(20×)

a. 低渗(150mOsmol·kg–1)刺激3h后的SG细胞; b. 等渗(300mOsmol·kg–1)培养3h的SG细胞; c.高渗(600mOsmol·kg–1)刺激3h后的SG细胞

Fig. 7 SG cells after osmotic stimulation. a. SG stimulated by hypoosmosis (150 mOsmol·kg–1) for 3h; b. SG cultured at 300 mOsmol·kg–1for 3h; c. SG stimulated by hyperosmosis (600 mOsmol·kg–1) for 3h

鳃组织直接暴露在水体环境中, 表面粘液较多, 易粘附水体中的细菌、寄生虫等污染物, 如何除去鳃组织表面污染物的同时还要保证细胞活性是鳃细胞系建立的关键步骤。本研究首先用75%酒精对整尾鱼进行短暂消毒, 去除表面细菌等污染物。取出的鳃组织用PBS和75%酒精交替冲洗, 严格控制每个环节的时间(PBS和75%酒精每次均冲洗1min), 避免损伤鳃细胞的同时有效清洗组织表面污染物和残留血液。本研究采用胰蛋白酶消化法建立SG细胞的原代培养体系, 将鳃组织冲洗干净后剪成小块放入胰蛋白酶中消化, 获得的原代细胞接种至培养瓶中。观察发现, 本研究所用的原代细胞获取方法, 避免了组织块迁出法中对分离出的原代细胞的机械损伤, 且细胞状态好, 数量多(Nathiga Nambi et al, 2017)。原代培养第6d鳃细胞开始贴壁, 第13d即可传代, 传代间隔时间为5d。观察斑马鱼()视网膜色素细胞、石斑鱼()脑细胞、大西洋鲑鱼()鳃细胞等上皮样细胞的形态(Wen et al, 2008; Nambi et al, 2015; Gjessing et al, 2018), 结合本文的图1b、图7b, 我们推测本研究分离出的鳃细胞主要为上皮样细胞。SG细胞培养中用L-15培养基作为基础培养基, 该培养基用半乳糖代替葡萄糖, 具有稳定的磷酸盐缓冲体系, 是鱼类细胞培养中应用最广泛的培养基(Fan et al, 2010; Lakra et al, 2011)。以往研究也表明, L-15也是金钱鱼肾脏细胞培养的最适培养基(张莹莹等, 2014)。鱼类细胞培养中, 培养基仅提供基础营养物质通常还需FBS等添加物, 提供细胞离体存活所需的未知因子等物质, 促进细胞贴壁和增殖。细胞传代培养中, FBS提供的蛋白酶抑制剂, 可以保护细胞不受剩余蛋白酶的消化(Zhu et al, 2013;王梦珣等, 2018)。本实验在L-15培养基中加入0、5%、10%、15%和20%的FBS, 观察其增殖情况发现, 细胞培养中FBS浓度为25%时SG细胞不增殖, 这可能是由于高浓度血清产生的代谢物较多, 从而抑制细胞增殖(Wang et al, 2010; Zhang et al, 2011;王英英等, 2017)。当不添加FBS时培养SG细胞6天, 细胞都未增殖, 说明FBS是SG细胞增殖所必须添加物。在含有20%FBS的培养基中发现SG细胞的增殖速度快于5%、10%和15%FBS培养的细胞, 因此SG细胞的最适血清浓度为20%。

温度是影响细胞体外培养的重要环境因子之一。与哺乳动物细胞相比, 鱼类细胞的耐温范围较广。本文通过对比20、24、28、32和36℃五种温度下SG细胞的增殖情况, 发现20~36℃范围内SG细胞均可增殖。在36℃培养时, 推测是温度过高抑制酶的活性(刘肖峰, 2015), 导致SG细胞从2d后增殖十分缓慢。32℃培养的SG细胞前期受温度影响较小, 但随着细胞数目的增加, 影响逐渐显著、增殖速度逐渐降低、培养的第5d细胞开始出现死亡。培养温度较低时(20℃和24℃), 细胞代谢速度的降低(刘肖峰, 2015), 导致SG细胞增殖减慢。

鳃细胞是参与渗透压调控的主要细胞类型, 虹鳟鳃细胞的渗透压耐受范围为175~550mOsmol·kg–1(Lee et al, 2009)。本研究发现SG细胞在150和600mOsmol·kg–1渗透压胁迫后均可生长, 说明其具有较强的渗透压耐受性。SG细胞在低渗胁迫的短时间内(3h)可能无法维持体内渗透压的稳定, 出现少量死亡, 待体内渗透压稳定后, SG细胞开始增殖。高渗胁迫后的48h内SG细胞增殖十分缓慢, 说明高渗胁迫对SG细胞的影响很大, SG细胞在维持体内渗透压稳定平衡的前提下, 很难生长。分析渗透压胁迫3h后SG细胞的增殖情况发现, SG细胞在低渗中的增殖速度是高渗胁迫的1.5倍, 表明SG细胞的低渗耐受力优于高渗。低渗胁迫培养SG细胞3h后体积发生明显膨胀, 高渗胁迫条件下SG细胞体积发生明显皱缩, 而离子的跨膜运输是引起细胞体积变化的主要原因(Fisher et al, 1984; Verbalis et al, 1991; Lang et al, 1998)。为避免细胞体积变化较大, 细胞会启动大量跨膜运输和代谢等机制进行调节, 这些机制不仅调节细胞体积的变化, 也影响细胞的功能调控(Lang et al, 1998), 因此细胞体积的变化是细胞渗透压调节机制中调节细胞性能的一个重要元素。

本研究采用胰蛋白酶消化法成功从金钱鱼鳃组织中获取SG原代细胞。研究表明, SG细胞培养的最适FBS浓度为20%, 28℃为该细胞的最适培养温度, 细胞的群体倍增时间为40.8h。对SG细胞的生长特性分析发现, 其在低渗和高渗胁迫后均可生长, 具有较强的渗透压耐受能力, 且低渗胁迫下的增殖速度是高渗胁迫的1.5倍。SG细胞系的建立为鱼类渗透压胁迫应答机制的研究提供理想实验材料。

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Establishment and characterization of gill cell line from the spotted scat

ZHOU Jianan1, SU Maoliang2, 3, ZHANG Junbin1, 2

1. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China;2. Shenzhen Key Laboratory of Marine Bioresource & Eco-Environmental Science, College of Life Sciences and Oceanography,Shenzhen University, Shenzhen 518060, China;3. Key Laboratory of Optoelectronic Devices and Systems of Ministry of Education and Guangdong Province, College of Optoelectronic Engineering, Shenzhen University, Shenzhen 518060, China

Gill is the main osmoregulatory organ in fish, and the establishment of gill cell can provide an important experimental platform to reveal the osmoregulatory mechanism. As a euryhaline fish,is an ideal animal model for such studies. This study aimed to establish the branchial cell line of.. The conditions for primary culture and subculture were optimized, and cell characteristics were analyzed. The optimum growth performance was observed in the branchial cell line of.at 28℃ in L-15 that contained 20% fetal bovine serum (FBS), and could be successfully subcultured in 2-4 days. The population doubling time (PDT) of SG (abbreviation for the branchial cell line established in present study) cell line was 40.8 h. Eighty-seven percent SG cells could be resuscitated after cryopreservation in liquid nitrogen. To adapt to the water environment, branchial cells could maintain homeostasis through the osmotic stress response mechanism. SG cells were grown in culture media at different osmotic pressures, and cell proliferation and morphological changes were observed in this study. SG cells could proliferate during hypotonic and hyperosmotic stress (150 and 600 mOsmol·kg–1), and the proliferation rate under hypotonic stress was 1.5 times higher than that under hyperosmotic stress. It was observed that the volume of SG cell expanded in the hypotonic medium and shrank in the hyperosmotic condition. Our results indicated that SG cells have strong osmotic tolerance, with a high adaptation in the hypoosmotic environment. The establishment of SG cell line provides basic experimental materials for the study of osmotic pressure response mechanism.

; gill cell line; primary culture; subculture

10.11978/2019017

http://www.jto.ac.cn

Q965.3

1009-5470(2019)06-0090-08

2019-02-18;

2019-04-03。

林强编辑

国家自然科学基金项目(41806177); 国家自然科学基金项目(41741006)

周佳楠(1995—), 女, 新疆维吾尔自治区昌吉市人, 硕士, 从事海洋生物学研究。E-mail: jiananzhou0608@163.com

张俊彬, 教授。E-mail: jbzhang@szu.edu.cn

2019-02-18;