肾康注射液指纹图谱的研究
2019-12-03孙小萌笔雪艳曲范娜张清波杨会兵
孙小萌,笔雪艳，曲范娜，张清波，杨会兵，张 雪，周 楠
(1.黑龙江中医药大学药学院，黑龙江 哈尔滨150040；2.黑龙江省食品药品检验检测所，黑龙江 哈尔滨150088；3.黑龙江省食品药品监督管理局，黑龙江 哈尔滨150001；4.西安世纪盛康药业有限公司，陕西 西安710300)
肾康注射液由大黄、丹参、黄芪和红花四味药材组成，是由西安世纪盛康药业有限公司生产。具有益气活血，降逆泄浊，通腑利湿的功效[1-2]。临床上主要用于治疗慢性肾衰竭，肺部感染，慢性阻塞性肺疾病急性加重，心力衰竭，恶性肿瘤，糖尿病，高尿酸血症等[3-4]。原标准执行国家食品药品监督管理局标准(试行)YBZ08522004，采用高效液相色谱方法，对四味药材分别建立了指纹图谱；但该标准检测耗时长，不便于日常大批量肾康注射液的质量检测，同时亦消耗较多的有机试剂，不利于节能环保。之后企业在进一步的修订过程中，虽然将四味药材合成一张指纹图谱，但依然采用了高效液相色谱法，所获得的图谱中化学成分信息量较小。而且现有标准未考察不同品牌液相色谱仪及色谱柱等对指纹图谱采集的影响，为该标准的提升及大批量的药品检验工作开展带来不便。基于指纹图谱信息量最大化，多品牌液相仪器均可重现实验结果的考虑，此次研究采用了超高效液相色谱方法，结合质谱定性鉴定了90%以上的色谱峰结构与归属；并采用了3个不同品牌的超高效液相色谱仪对所建立的指纹图谱进行验证，得到了较为满意的结果。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Waters超高效液相色谱仪，配有四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、紫外检测器；ACQUITY UPLC®CSH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7μm)；Waters Acquity I class UPLC G2-XS Q Tof四级杆-飞行时间质谱仪；XS205DU电子天平。
1.2 试剂
甲醇(色谱纯、Dikma 公司)；甲酸(质谱级)；纯化水(实验室自制)。
1.3 对照品
毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号：111920-201304)、原儿茶醛(批号：110810-201007)均购自中国食品药品检定研究院。
1.4 样品
肾康注射液(批号：201211041、201306027、201307011、201312011、201402012、201403023、201404031、201405021、20141104、201505023、201501011、201502013、201503021、201504011、201510021、201507021、201508023、201509041、201510053、201511021)，共20批，均由西安世纪盛康药业有限公司生产。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
以ACQUITY UPLC®CSH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7μm)，以甲醇(A)和0.1%甲酸(B)为流动相，梯度洗脱(0～3 min,1% A；3～15 min,1% A→4% A；15～55 min，4% A→40% A；55～65 min，40% A→60% A；65～66 min，60% A→90% A；66～69 min，90% A)；流速为0.4 ml/min，检测波长为280 nm，进样量2 μl,柱温30 ℃。
2.2 质谱条件
采用ESI离子源，负离子模式，毛细管电压设定为2.50 V，离子源温度120 ℃，脱溶剂气温度500 ℃，锥孔电压40 V；质谱方法：全信息串联质谱(MSE)；质量数50～1 200 Da；碰撞能量20～40 V。
2.3 对照品与供试品溶液的制备
对照品溶液的制备：精密称取原儿茶醛对照品和毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，分别加甲醇制成浓度均为10 μg/ml的对照品溶液。
供试品溶液的制备：取肾康注射液适量，用0.22 μm的微孔滤膜过滤，即得。
2.4 方法学考察
2.4.1精密度试验
取批号为201403023样品，按照“2.3”项下处理样品，按照“2.1”项下条件进样测定，连续进样5次，考察指纹图谱精密度。将精密度实验色谱图导入《中药指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版)》，计算相似度，其平均值为0.965，RSD为0.06%，表明仪器精密度较高。
2.4.2重复性试验
取同一批号的肾康注射液(批号：201403023)，供试品溶液的制备按“2.3”项下处理，平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下条件进样测定，考察指纹图谱的变化情况。将重复性实验色谱图导入《中药指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版)》，计算相似度，其平均值0.965，RSD为0.08%，表明该方法重复性良好。
2.4.3稳定性试验
按照“2.3”项下方法制备肾康注射液(批号：201403023)供试品溶液一份，于常温下保存，按“2.1”项下条件进样测定，分别在0、6、12、20、24 h测定供试品溶液，考察稳定性，将稳定性实验色谱图导入《中药指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版)》，计算相似度，其平均值是0.965，RSD值为0.06%，说明肾康注射液供试品溶液在24 h内稳定。
3 结果
3.1 肾康注射液UPLC指纹图谱
取20批不同批次的肾康注射液样品，按照“2.3”项下处理对照品及供试品，按照“2.1”、“2.2”项下条件测定样品的指纹图谱，数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究(2012.130723版)》，以所确定的16个共有峰进行校正处理，生成肾康注射液指纹图谱与对照品对比图(图1)、肾康注射液对照指纹图谱(图2)、不同批次的叠加指纹图谱(图3)。
取20批不同批次的肾康注射液按上述“2.1”、“2.2”、“2.3”项下测定样品的指纹图谱，将所得的样品指纹图谱与上述所得的对照指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究(2012.130723版)》各自进行全图匹配，16点校正，计算各批样品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度，结果20批注射液相似度均大于0.90，20批样品相似度的RSD为1.79%。表明不同批次肾康注射液相似度较高，指纹图谱相似性良好说明工艺稳定。
3.2 肾康注射液特征峰指认
质谱采用负离子模式，方法是MSE，对肾康注射液UPLC指纹图谱标示的主要色谱峰进行质谱确认，根据主要成分的色谱行为，结构信息，结合文献[5-8]及对照品，推测了肾康注射液UPLC指纹图谱的26个主要色谱峰。结果见图4和表1。
图1 肾康注射液指纹图谱与对照品色谱图比较 A.对照品色谱图；B.对照品色谱图；C.肾康注射液指纹图谱；1.原儿茶醛；2.毛蕊异黄酮葡萄糖苷
图2 肾康注射液对照指纹图谱
图3 6批肾康注射液UPLC指纹图谱叠加图
图4 肾康注射液的质谱图
4 讨论
4.1 药材与肾康注射液指纹图谱中特征峰的归属研究
供试品溶液的色谱图与对照指纹图谱(见图2)基本一致，主要的色谱峰应在65 min以内出完，且分离良好。供试品肾康注射液指纹图谱共有16个特征峰，依次对应表1中序号1～16的成分。其中2号峰和10号峰由对照品定位，分别依次是原儿茶醛、毛蕊异黄酮葡萄糖苷(见图1)。由图5～8可知，大黄药材与供试品指纹图谱中特征峰共有的是5、6、7、9、10、11、12、14、15、16号峰，共计归属10个峰(见图5)。黄芪药材与供试品指纹图谱中特征峰共有的是10号峰，共计归属1个峰(见图6)。红花药材与供试品指纹图谱中特征峰共有的是3、8、9、13号峰，共计归属4个峰(见图7)。丹参药材与供试品指纹图谱中特征峰共有的是1、2、14号峰，共计归属3个峰(见图8)。10号峰毛蕊异黄酮葡萄糖苷是大黄、黄芪药材所共有的；9号峰是大黄、红花药材所共有的；14号峰为丹参与大黄药材所共有；4号峰是四味药材制成注射液后新生成的色谱峰。
4.2 中间体与肾康注射液成品的主成分归属
中间体A是由丹参黄芪生成，采用“2.1”、“2.2”项下条件分析，结果见图9和表1，结合质谱鉴定出中间体A中13个成分，与肾康注射液已鉴定的26个成分进行归属(见图4和表1)，发现中间体A中的全部成分均能归属在样品肾康注射液中。
中间体B由红花，大黄组成，采用“2.1”、“2.2”项下条件分析，结果见图10和表1，推测了其中9个成分。与肾康注射液已鉴定的26个成分进行归属(见图4和表1)，共有成分有5个，分别是对应表1中序号为4、6、14、15、16号。
中间体A和中间体B共有的成分有2个，分别对应表1中序号为14、16号成分。二者与成品成分进行归属，合计归属了16个色谱峰，分别对应表1中序号是1、2、4、6、14、15、16、17、19、20、21、22、23号。
中间体B 在制成成品的过程中丢失了4个成分，分别是没食子酸、山柰酚-3-O-芸香糖苷、奥刀拉亭-7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷。肾康注射液中的成分经中间体A、B归属后，未归属的成分有10个，分别对应表1中序号是3、5、7、8、9、10、11、12、13、18号。
4.3 不同色谱柱的考察
确定指纹图谱的色谱条件后，为考察不同色谱柱对指纹图谱重现性的影响，对3种不同品牌的色谱柱进行考察。3种色谱柱的信息见表2。根据色谱峰的峰形、分离度效果进行选择。实验结果表明，不同色谱柱分离效果相差较大，色谱峰峰形和分离效果较好的是ACQUITY UPLC®CSH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)。提示建立本指纹图谱需要固定色谱柱型号，因此，建议选用该型号色谱柱。
表2 三种色谱柱的信息
4.4 不同品牌UPLC色谱仪的考察
应用同一种型号色谱柱ACQUITY UPLC CSH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，在相同的色谱条件下，随机选取一批肾康注射液(批号：201507021)，分别在沃特世(Waters)、赛默飞世尔(Thermofisher)和安捷伦(Agilent)三个品牌的超高效液相色谱仪上进行检测，同一批次样品在不同仪器上所得图谱相似度分别为：Waters：0.901；Thermofisher：0.903；Agilent：0.900，表明重现性良好，不同品牌仪器得到的色谱图相似度结果差别不大。
4.5 对照品的选择
大黄、丹参、红花和黄芪都是常用的中药材，所含成分的含量测定与药理实验均有较多的报导。根据上述优化后的色谱条件，对四味药材中常用于测定含量并具有药理活性的对照品进行检测(见表3)，结果表明，原儿茶醛对照品与毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品可以做为色谱峰定位的参考(见图1)。由于实验条件有限，后期会收集更多的对照品进行研究。
表3 对照品的选择
4.6 小结
中药指纹图谱具有整体性和模糊性的基本属性，能够较全面的反应中药材中所含化学成分的种类和数量，能更加客观的从整体上评价中药的内在质量。相较单一成分或指标性成分评价中药的质量更加科学全面。本文主要对不同批次肾康注射液成品展开研究，经相似度计算，表明各批次间相似度相差不大，质量稳定。下一步将收集更多的样品，并进行中间体的研究，控制生产工艺对质量的影响，为肾康注射液质量控制提供更多的理论支持。
利用UPLC法建立的肾康注射液指纹图谱方法，经方法学验证具有良好的精密度，重复性和稳定性。文中利用UPLC-MS技术，建立肾康注射液四味药材的指纹图谱，其灵敏度高，稳定性好，重复性高，给出的信息更加全面。指纹图谱鉴定归属26个色谱峰，进一步阐明肾康注射液的化学物质基础，为肾康注射液的质量控制提供了新依据。
