冰糖草茎叶总黄酮测定及其清除亚硝酸盐的作用

劳佳丽 高丽玉 陈丽珍 鱼清雅 毕进 张思程

摘      要：为了建立冰糖草茎叶总黄酮的含量测定方法，并研究其对亚硝酸盐的清除作用。以芦丁为对照品，采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色法及分光光度法测定冰糖草茎叶总黄酮含量;以Vc为对照，采用对氨基苯磺酸-盐酸奈乙二胺分光光度法，评价总黄酮对亚硝酸盐的清除作用。考察的结果符合定量要求，芦丁质量浓度在4.9～78.7 μg/mL的范围内，吸光度线性关系良好（r = 0.999 8），平均回收率为100.9%，RSD为1.7%（ n=6）。冰糖草茎叶总黃酮对亚硝酸盐具有较好的清除作用，且总黄酮对亚硝酸盐的清除率与用量呈正相关性，当总黄酮用量从0.5 mg增加至7 mg时，清除率从（9.83±2.49）%逐渐增加至（88.43±0.47）%，且5.0 mg的总黄酮与0.5 mg的Vc对亚硝酸盐的清除效果相当。

关  键  词：冰糖草;总黄酮;含量测定;清除亚硝酸盐

中图分类号：R 284       文献标识码： A       文章编号： 1671-0460（2019）10-2202-04

Abstract： A method for determining the content of total flavonoids in Scoparia dulcis L.stems and leaves was established， and its nitrite scavenging ability was studied. The content of total flavonoids in Scoparia dulcis L.stems and leaves was determined by spectrophotometry and sodium nitrite-aluminum nitrate-sodium hydroxide colorimetry using rutin as comparison sample，and p-aminobenzenesulfonic acid-naphthylamine hydrochloride spectrophotometry was employed to evaluate its nitrite scavenging ability with vitamin C as the control. The results were in accordance with the quantitative requirements by the methodological study. There was a good linear relationship （ r =0.999 8） in the range of 4.9～78.7μg/mL of rutin，and the average recovery ratio was 100.9% with RSD less than 1.7% （n=6）. The method is simple，rapid，accurate and credible. The total flavonoids in Scoparia dulcis L.stems and leaves had good scavenging effect on nitrite.The clearance rate to nitrite from total flavonoids was positively correlated with its concentration. The clearance rate increased from （9.83±2.49）% to （88.43±0.47）% when the average of flavonoids was from 0.5mg to 7.0 mg.The nitrite scavenging effect of 5.0 mg total flavonoids was equivalent to that of 0.5 mg vitamin C.

Key words： Scoparia dulcis L; Total flavonoids; Determination of content; Scavenging nitrite

冰糖草为玄参科野甘草属植物野甘草Scoparia dulcis L.的全草，广泛生长于我国海南各地，及广西、广东、福建、云南等热带与亚热带地区。冰糖草味甘，性凉，是一味常用民族药;其具有清热解毒、健胃镇咳、利尿消肿、祛风止痒等功效，常用于肺热咳嗽、小便不利、湿热黄疸、热痱湿疹、胃病肠炎和高血压等症[1，2]。海南黎族民间常用其配方入药治疗疾病[3]。冰糖草的研究主要有在质量控制[3]、化学成分[4，5]、药理活性[6，7]等方面，也表明其含有黄酮类、二萜类、生物碱等化学成分[2]。总黄酮是植物次级代谢产物，存在于高等植物的所有部分，尤其是叶和花中，具有清除氧自由基抗氧化、防治心血管疾病、抗菌抗病毒、抗肿瘤抗癌、抗损伤保肝、调节免疫等多种生理与药理活性[8]，在医药、食品保健等方面有广泛应用。目前有少量文献报道冰糖草中总黄酮的提取工艺含量测定方面的研究[9-11]，但关于冰糖草茎叶总黄酮含量及其清除亚硝酸盐的研究尚未见报道。且考虑到测定总黄酮含量的方法的简便快捷与可行性，多采用分光光度法测定黄酮类化合物含量[9，10]。鉴于此，通过提取冰糖草茎叶总黄酮，建立其含量测定方法，并考察其亚硝酸盐清除能力，旨在为冰糖草的有效成分的进一步开发利用提供科学的参考依据。

1  实验部分

1.1  材料与试剂

冰糖草采自海南省万宁市龙滚镇，经海南医学院药学院曾念开教授鉴定为玄参科植物野甘草Scoparia dulcis L.的全草，分取茎叶部分，烘干粉粹，过80目筛，密封低温保存备用。芦丁对照品（上海源叶，纯度≥98%），乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、对氨基苯磺酸盐酸萘乙二胺等均为分析纯;实验用水为双蒸水。

1.2  仪器

DFY-1000D封闭式粉碎机（林大机械），DHG-9075A电热干燥箱（上海一恒），SK3210HP超声波清洗器（上海科导），SHZ-D循環水式真空泵（巩义予华），RE-2000B型旋转蒸发器（上海亚荣），AE100电子分析天平（上海梅特勒-托利多），UV-1600紫外可见分光光度计（北京瑞利）。

1.3  方法

1.3.1  对照品溶液的制备

精密称取在105 ℃下干燥至恒重的芦丁对照品12.3 mg，置于50 mL容量瓶中，加70%乙醇适量，超声5 min使溶解，冷却后定容，混匀得质量浓度为0.246 0 mg/mL芦丁对照品溶液。

1.3.2  供试品溶液的制备[11]

称取冰糖草茎叶粉末4.0 g，精密称定，置于锥形瓶中，按料液比1 g∶30 mL加入80%乙醇充分浸泡;在50 ℃、250 W超声功率下超声提取80 min，抽滤，提取2次，合并滤液，定容于容量瓶即得供试品溶液。

1.3.3  含量测定方法[9，10]

准确吸取供试品溶液2 mL加入25 mL容量瓶内，分别加入5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀暗置6 min;加入10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀暗置6 min;最后加入4%氢氧化钠溶液4 mL，加蒸馏水定容，摇匀静置15 min;以试剂空白作参比，在510 nm波长处测定吸光度;按（1）式计算：

总黄酮含量：w =（c×v×d）/m        （1）

式中：w—冰糖草茎叶总黄酮含量，mg/g;

c—根据标准曲线计算的总黄酮浓度，mg/mL;

v—提取液（即供试品溶液）总体积，mL;

d—稀释倍数;

m—冰糖草茎叶粉末质量，g。

1.3.4  方法学考察[12]

（1）线性关系考察

准确吸取芦丁对照品溶液0.5、1、2、4、6、8 mL，分别置于25 mL容量瓶内，按“1.3.3”项下方法处理后测定吸光度，并以芦丁质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

（2）精密度试验

准确吸取供试品溶液2 mL，按“1.3.3”项下方法处理后测定吸光度，连续测定6次，计算RSD值，考查方法的仪器精密度。

（3）稳定性试验

准确吸取同一供试品溶液2 mL，按“1.3.3”项下方法处理，在室温和室内光照条件下密闭放置，在0～120 min内每隔20 min重复测定其吸光度，计算RSD值，考查供试品溶液在相同条件下放置3 h的稳定性。

（4）加样回收率试验

精密称取已知总黄酮含量为25.13 mg/g的冰糖草茎叶粉末2.0 g，6份，加入一定量的芦丁对照品，按“1.3.2”项下方法制备供试品溶液;准确吸取供试品溶液各2 mL，按“1.3.3”项下方法处理后测定吸光度，计算回收率和RSD值，考查方法的可行性和准确度。

1.3.5  样品测定

精密称取冰糖草茎叶粉末4.0 g，6份，按“1.3.2”项下方法处理后制备样品溶液;准确量取样品溶液各2 mL，按“1.3.3”项下方法处理后测定吸光度，计算总黄酮含量和RSD值。

1.3.6  冰糖草茎叶总黄酮对亚硝酸盐的清除作用

将冰糖草茎叶总黄酮提取液合并减压浓缩即得浓缩液;准确吸取提取液的浓缩液，以芦丁为对照品测定其总黄酮含量，再将该浓缩液用70%乙醇稀释到1 mg/mL待测样液，用于实验。采用对氨基苯磺酸-盐酸奈乙二胺分光光度法及参照李容等方法略作修改[13-14]。在比色管中分别加入一定量的冰糖草茎叶总黄酮溶液、2 mL 5 μg/mL亚硝酸钠溶液，匀后加入2 mL 0.4%对氨基苯磺酸，混匀后静置5 min，再加入1 mL 0.2%盐酸萘乙二胺溶液，加蒸馏水定容至25 mL，混匀后静置15 min，在确定的最大吸收波长538 nm下测定吸光值A样品，以80%乙醇代替总黄酮溶液的空白对照试验测定吸光度A对照。总黄酮粗提物对亚硝酸盐的清除率按（2）式计算：

亚硝酸盐清除率=（A对照-A样品）/A对照×100%  （2）

2  结果与分析

2.1  方法学考察结果

2.1.1  芦丁标准曲线

以芦丁质量浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标，采用Excel绘制了芦丁标准曲线，分析得线性回归方程为：A = 11.186 C - 0.008 8，r = 0.999 8。结果表明芦丁质量浓度在4.9～78.7 μg/mL范围内呈良好线性关系，符合定量分析要求。

2.1.2  精密度试验

由试验结果可知，供试品溶液的6次测试的吸光度RSD值为1.08%（n=6），小于2 %，表明该方法具有良好的精密度，符合测定要求。

2.1.3  稳定性试验

由试验结果可知，室温条件下在0～120 min内供试品溶液的吸光度RSD值为1.03%（n=7），小于2%。表明在测定时间内供试品溶液是稳定的，经时稳定性符合一般分析时间要求。

2.1.4  加样回收率试验

试验结果见表1，可知回收率值在98.6%～103.1%之间波动，回收率平均值为100.9%，RSD值为1.7% （n=6），小于2%。表明该方法准确度良好，符合测定要求。

2.2  冰糖草茎叶总黄酮含量测定

测定结果见表2，平均含量为25.13 mg/g，RSD 值为1.14% （n=6），小于2%。

2.3  冰糖草茎叶总黄酮对亚硝酸盐的清除作用

冰糖草茎叶总黄酮和Vc对亚硝酸盐的清除效率结果见表3，由表中数据绘制了总黄酮和Vc用量对清除率的关系曲线见图1。

由图1（a）可知Vc的用量与清除率基本上呈正相关性。当Vc的用量为0.1 mg时，其对亚硝酸盐的清除率达到48.29%，随用量增大，清除率明显增强，且当增大到2.0 mg时，清除率可达到100%。表明Vc具有很好的清除亚硝酸盐作用。

由图1（b）可知总黄酮的用量与清除率基本上呈正相关性。当总黄酮的用量较小为0.5 mg时，对亚硝酸盐的清除作用较弱为9.83%，随用量增加至4.0 mg时，对亚硝酸盐的清除率明显提高到60.54%，继续增加用量从4.0 mg到7.0 mg，清除率继续由82.35%增强到88.43%;随后再增加用量，清除率不再增加，基本达到一个平衡。表明冰糖草茎叶总黄酮具有较强的清除亚硝酸盐的能力，且5.0 mg的总黄酮与0.5 mg的Vc对亚硝酸盐的清除效果相当。

3  结 论

黄酮类化合物是指母核具有C6-C3-C6基本骨架，且常有羟基、甲氧基、甲基、异戊烯基等取代基的一类化合物，其常与糖结合成苷类，小部分以游离态苷元的形式存在[8]。采用超声波辅助乙醇提取法提取冰糖草茎叶总黄酮，应用分光光度法建立了测定总黄酮含量的方法，即以芦丁为对照品，经亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法显色后测得冰糖草茎叶总黄酮含量为25.13 mg/g，高于谭小玉[3]采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色反应体系所测得的海南冰糖草中总黄酮的含量16.948 mg/g，这可能是由生长环境、气候变化等因素导致总黄酮含量有所差异，更有待进一步的深入研究。该测定方法精密度好、稳定，加样回收率值在98.6%～103.1%之间，达到了定量分析的要求;操作简便快速，准确可靠，为冰糖草总黄酮的深入研究和开发利用提供参考。

亚硝酸盐是具有致癌作用N-亚硝基化合物生成的前体物质[13]，研究表明胃癌、食道癌、肝癌等癌症发病率与人体对亚硝酸盐的摄入量密切相关[15]，所以寻找有效的清除亚硝酸盐或其前体的物质是防癌的途径之一。冰糖草茎叶总黄酮对亚硝酸盐消除实验表明，随总黄酮用量的增加，其清除亚硝酸盐的能力明显增强，清除率可达到88.43%，且5.0 mg的总黄酮与0.5 mg的Vc对亚硝酸盐的清除效果相当，说明冰糖草茎叶总黄酮有较强的清除亚硝酸盐作用，这可能与抗氧化活性有关，可为冰糖草的进一步开发利用提供理论依据与新的思路。

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