EGCG对电离辐射所致豚鼠听功能和耳蜗毛细胞损伤的影响

徐亚雄 罗香林 丰俊 李楚凌

【摘要】 目的 探讨表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对电离辐射所致豚鼠听功能和耳蜗毛细胞损伤的保护作用。方法 24只豚鼠， 按照随机数字表法分为对照组、EGCG+辐射组及辐射组， 每组8只。EGCG+辐射组及辐射组于造模前3 d开始腹腔注射EGCG（25 mg/1000 g）及等量的生理盐水， 2次/d;对照组不做任何处理。在照射前第4天及照射后第8天检测所有豚鼠的听觉脑干诱发电位（ABR）阈值， 照射8 d后于显微镜下计数毛细胞数量。比较三组的ABR阈值检测结果、耳蜗铺片及细胞计数。结果 干预后8 d， EGCG+辐射组ABR阈值（38.1±3.3）dB低于辐射组的（49.4±8.6）dB， 差异具有统计学意义（P<0.05）;干预后8 d， EGCG+輻射组和辐射组的ABR阈值与干预前4 d的（19.3±5.5）、（21.0±3.7）dB对比明显升高， 差异具有统计学意义（P<0.05）。辐射组实验动物的耳蜗毛细胞数量降低， 形态改变， 排列杂乱不齐， 造模成功;EGCG+辐射组显微镜镜检表明耳蜗毛细胞数与对照组相比有所降低， 排列较为杂乱， 但与辐射组相比形态结构较好。对照组耳蜗毛细胞计数为（1102.23±80.55）个， EGCG+辐射组耳蜗毛细胞计数为（758.56±143.27）个， 辐射组耳蜗毛细胞计数为（527.00±165.23）个， EGCG+辐射组、辐射组耳蜗毛细胞计数均低于对照组， 辐射组耳蜗毛细胞计数低于EGCG+辐射组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。结论 对豚鼠预防性注射EGCG能够有效降低电离辐射对听功能和耳蜗毛细胞损伤作用， 对电离辐射所致的听力损伤具有一定的防护作用。

【关键词】 表没食子儿茶素没食子酸酯;电离辐射;豚鼠;听功能;耳蜗毛细胞

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.29.111

目前， 临床针对恶性肿瘤的治疗， 已经逐渐将电离辐射作为常用治疗手段， 但是在治疗的过程中， 该治疗手段容易对患者造成一定负性影响， 如导致其细胞、非靶组织出现严重受损的情况。其中对于头颈部肿瘤患者来说， 在进行放射治疗中最为常见的一种并发症便是感音性耳聋（SNHL）。且目前已有相关研究表明辐射对耳蜗毛细胞具有损伤作用， 能够改变毛细胞的形态[1]。绿茶提取物——EGCG的化学结构中存在较多的酚羟基， 具有较强的抗氧化能力[2];EGCG能够通过抑制炎性因子及纤维化调节因子等转录分泌， 缓解肝脏中CCl4所导致的氧化应急反应[3]。因此， 抗氧化剂EGCG对电离辐射所致的耳蜗损伤的作用具有较高的研究价值。

1 材料与方法

1. 1 材料 选取24只雄性健康成年豚鼠作为研究对象， 体重300～350 g， 耳廓反射检查正常， 由北京维通利华实验动物技术有限公司提供;按照随机数字表法分为对照组、EGCG+辐射组及辐射组， 每组8只。

1. 2 实验方法

1. 2. 1 耳蜗损伤模型的建立 EGCG+辐射组及辐射组采用10%水合氯醛麻醉后， 固定于鼠板上， 采用自制的“U”形夹头铅板遮蔽豚鼠非处理部分， 60Co远距离治疗机对实验动物进行一次性的60Co照射70 Gy， 照射深度为2.0 cm， 照射范围以耳蜗为中心的2 cm×2 cm范围内;对照组豚鼠不做处理。辐射组检测ABR阈值高于对照组则表明耳蜗损伤模型造模成功。

1. 2. 2 给药方法 EGCG+辐射组及辐射组于造模前3 d开始腹腔注射EGCG（25 mg/1000 g）及等量的生理盐水， 2次/d;对照组不做任何处理。

1. 2. 3 ABR检测 在照射前第4天及照射后第8天检测所有豚鼠的ABR， 采用10%水合氯醛麻醉。以实验动物颅顶正中皮下作为正极， 给声侧耳廓后作为负极。对实验动物进行以2000 Hz为主的短声进行刺激， 刺激间隔时间为90 ms， 带通滤波50～3000 Hz， 共刺激200次， 扫描时程为20 ms。声波开始强度以95 dB开始， 并以5 dB为梯度逐渐降低， 观察P3波以确定实验动物两耳的ABR阈值。

1. 2. 4 耳蜗铺片观察毛细胞组织结构及计数 照射8 d后刺死动物同时取右侧听泡打开， 于蜗尖处开孔， 以暴露卵圆窗和圆窗。蜗尖采用0.5%的硝酸银溶液冲洗2～3次， 随后采用10%的多聚甲醛灌入后日光下曝光2～3 h， 取基底膜于100倍光镜下观察毛细胞组织结构及计数， 由底回段到顶回段逐级计数， 计数各回段每排毛细胞在单位长度内的个数， 各回段计数总和即为毛细胞总数。

1. 3 观察指标 比较三组的ABR阈值检测结果、耳蜗铺片及细胞计数。

1. 4 统计学方法 采用SPSS20.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用LSD-t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 三组ABR阈值检测结果对比 干预后8 d， EGCG+辐射组ABR阈值（38.1±3.3）dB低于辐射组的（49.4±8.6）dB， 差异具有统计学意义（P<0.05）;干预后8 d， EGCG+辐射组与辐射组的ABR阈值与干预前4 d的（19.3±5.5）、（21.0±3.7）dB对比明显升高， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2. 2 三组耳蜗铺片及细胞计数对比 耳蜗铺片显微镜计数检查表明， 辐射组实验动物的耳蜗毛细胞数量降低， 形态改变， 排列杂乱不齐， 造模成功;EGCG+辐射组显微镜镜检表明耳蜗毛细胞数与对照组相比有所降低， 排列较为杂乱， 但与辐射组相比形态结构较好。对照组耳蜗毛细胞计数为（1102.23±80.55）个， EGCG+辐射组耳蜗毛细胞计数为（758.56±143.27）个， 辐射组耳蜗毛细胞计数为（527.00±165.23）个， EGCG+辐射组、辐射组耳蜗毛细胞计数均低于对照组， 辐射组耳蜗毛细胞计数低于EGCG+辐射组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

放射治疗是现阶段鼻咽癌、腮腺癌等头颈部恶性肿瘤使用较多的常规治疗方式， 主要放射治疗区域包括耳在内的颞骨区。在针对患者进行临床治疗时， 患者存在不同程度的听力降低情况， 通过进行动物实验发现常规治疗剂量的放射线， 便会对内耳耳蜗造成一定程度损伤， 导致患者听力下降[4]， 另外相关研究进一步证明， 内耳损伤的程度与放射剂量相关， 现阶段多认为放射剂量达到60 Gy时即可导致内耳出现损伤， 为头颈部恶性肿瘤最常见的并发症之一， 现阶段临床中多以50 Gy为内耳损伤的剂量临界值[5]。EGCG为茶多酚中抗氧化作用最高的成分之一， 该物质的化学结构中富含酚羟基， 其抗氧化能力为超氧化物歧化酶的6倍、维生素E的20倍， 具有较强的抗炎、清除机体自由基以及对神经系统的保护等多种作用[6]。

本研究采用EGCG对电离辐射大鼠进行干预， 结果表明：干预后8 d， EGCG+辐射组ABR阈值（38.1±3.3）dB低于辐射组的（49.4±8.6）dB， 差异具有统计学意义（P<0.05）;干预后8 d， EGCG+辐射组和辐射组的ABR阈值与干预前4 d的（19.3±5.5）、（21.0±3.7）dB对比明显升高， 差异具有统计学意义（P<0.05）。辐射组实验动物的耳蜗毛细胞数量降低， 形态改变， 排列杂乱不齐， 造模成功;EGCG+辐射组显微镜镜检表明耳蜗毛细胞数与对照组相比有所降低， 排列较为杂乱， 但与辐射组相比形态结构较好。对照组耳蜗毛细胞计数为（1102.23±80.55）个， EGCG+辐射组耳蜗毛细胞计数为（758.56±143.27）个， 辐射组耳蜗毛细胞计数为（527.00±165.23）个， EGCG+辐射组、辐射组耳蜗毛细胞计数均低于对照组， 辐射组耳蜗毛细胞计数低于EGCG+辐射组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。

综上所述， 对豚鼠预防性注射EGCG能够有效降低电离辐射对听功能和耳蜗毛细胞损伤作用， 对电离辐射所致的听力损伤具有一定的防护作用。

参考文献

[1] 杨衬， 张威， 刘小龙， 等. 单次不同放射线剂量和时间对Balb/c小鼠耳蜗显微和超微结构的影响. 临床耳鼻咽喉头颈外科杂志， 2014， 28（13）：979-982.

[2] 刘婷婷， 孟馨. 表没食子儿茶素没食子酸酯抗氧化作用机制的研究进展. 现代药物与临床， 2016， 31（6）：919-923.

[3] 罗可望， 龙颖妍， 黄卫人. 表没食子儿茶素没食子酸酯抗肿瘤作用的研究进展. 医学综述， 2017， 23（10）：1929-1934.

[4] 赵向东， 梁勇， 任陈， 等. 不同剂量放射线对小鼠畸变产物耳声发射和外毛细胞Prestin蛋白表达的影响. 听力学及言语疾病杂志， 2013， 21（3）：267-271.

[5] 文果， 覃玉桃. 鼻咽癌治疗相关听力损伤研究进展. 中华耳科学杂志， 2018， 16（5）：640-645.

[6] 严正強， 陈铁定， 陈力， 等. 茶多酚对人前列腺癌PC-3M细胞侵袭力的影响. 浙江医学， 2017， 39（12）：946-951.

[收稿日期：2019-02-14]