Graves病患者外周血单个核细胞中microRNA-142-3p的表达水平及其意义

胡 婷 裴晓艳 于 磊 徐二琴 金国玺

Graves病是一种自身免疫性疾病，Graves病在女性中发生率约为3%，另有0.5%的男性在其一生中会有发展为Graves病的可能性[1]。微小RNA是一类广泛存在于真核生物中的非编码单链小RNA分子，通过降解靶基因mRNA 或抑制其蛋白质产物的生成参与调控人体一系列重要生理病理反应，特别是与机体免疫功能关联密切。近年来，越来越多的研究表明许多微小RNA在甲状腺功能亢进中发挥重要作用[2]。有研究报道在甲状腺组织以及Graves病患者中有miRNA异常调节的现象，有些与外周血单核细胞表达有关的特定miRNA可能成为治疗Graves病的新靶点[3，4]。未成熟的miR-142产生两种异构形式，即引导链miR-142-3p和副链miR-142-5p，其中miR-142-3p主要分布于T细胞，起到CD4+T细胞负性调控因子的作用，能够降低CD4+T细胞的生物活性。miR-142-3p表达失调与多种人类疾病有关，包括各种炎性疾病、癌症、胚胎发育异常等，尤其是对免疫相关疾病有较大影响[5，6]。探索miR-142-3p在各种疾病中的作用逐渐成为研究热点，但其在甲状腺自身免疫性疾病中的国内外研究极少，尤其是Graves病方面，国内目前仍未见相关报道。本项实验拟探究miR-142-3p在Graves病中的可能作用，并试讨论其能否成为Graves病诊治的新的生物学标志物与干预靶点。

对象与方法

1.研究对象：选择2018年2月～2018年7月期间于蚌埠医学院第一附属医院内分泌科门诊确诊为Graves病的患者37例，同期收集体检中心的健康志愿者15例，分别作为GD组和正常对照组。两组研究对象性别、年龄等一般情况比较，差异无统计学意义。本实验已取得笔者医院伦理学委员会审批，所有患者均知情同意，并签署知情同意书。

2.GD组纳入标准：①患者有多食善饥、体重降低、怕热多汗、心率增快等高代谢症状和体征；②甲状腺不同程度肿大；③外周血FT3、FT4增高，TSH减低，TRAb增高。排除标准：妊娠或哺乳期女性、合并感染者、合并其他内分泌疾病、合并其他各系统器质性疾病。

3.正常对照组(健康组)纳入标准：①外周血 FT3、FT4、TSH 正常；②全身各系统体检结果正常；③年龄、性别与GD组相匹配。妊娠、哺乳期女性除外。

4.PBMC与提取总RNA:两组研究对象分别于清晨抽取外周静脉血5ml，全血置于EDTA抗凝管中，加入淋巴细胞分离液5ml，以密度梯度离心法进行分离，取其外周血单个核细胞(PBMC)。用总RNA快速提取试剂盒(上海Sagon公司)按操作说明提取总RNA。

5.RT-qPCR检测miR-142-3p表达水平：采用ABScriptⅡ cDNA First-Strand Synthesis Kit试剂盒(武汉ABclonal公司)进行反转录反应；采用2X SYBR Green Fast qPCR Mix No Rox试剂盒(武汉ABclonal公司)进行qPCR。该实验以U6为内参，U6和miRNA引物由上海傲集生物科技有限公司合成。miR-142-3p反转录引物序列：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-TCCATA-3′； miR-142-3p上游引物序列：5′-CAGCTGGGTGTAGTGTTTCCTACTT-3′；MiR-142-3p下游引物序列：5′-ACGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；U6上游引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；U6下游引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；RT反应体系：2μg RNA溶液，Oligo(dT)18(1μl)，5×Reaction Buffer(4μl)，10mmol/L dNTP Mix(2μl)，RNAase抑制剂(20U/μl，1μl)和反转录酶(200U/μl，1μl)。65℃预变性5min，42℃保温60min，结束后70℃保温5min灭活反转录酶。qPCR反应体系：2×qPCR Mix(12.5μl)；7.5μmol/L基因引物(2.0μl)；反转录产物(2.5μl)；ddH2O(8.0μl)。反应条件95℃预变性10min， 95℃15s，60℃60s，循环40次，反应结束后60℃→95℃，每30s升温1℃条件下进行熔解曲线分析。每个样本均进行3次检测，应用2- △△ C t法计算miRNA-142-3p的相对表达水平。

6.ELISA法检测相关指标：每例于清晨空腹抽取外周静脉血2ml，室温静置1h后在4℃下以3000r/min离心10min，取上层血清进行检测，采用化学发光法，测定血清TSH、TT3、TT4、FT3、FT4、TRAb等指标(美国Siemens Healthcare Diagnostics公司)。

7.统计学方法：本研究采用Graph Pad Prism 5.0做图，采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行统计分析，计量资料用均数±标准差(x±s)表示，数据符合正态分布采用t检验。组内相关性分析用Pearson相关性分析法。运用受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线分析miR-142-3p的诊断价值。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.两组PBMC中miR-142-3p表达水平比较：GD组PBMC中miR-142-3p的表达水平(0.378±0.199)较正常对照组(1.104±0.421)明显降低(P=0.003，图1)。

图1 正常对照组与GD组PBMC中miR-142-3p相对表达水平比较

2.miR-142-3P与TT3、TT4、FT3、FT4、TRAb等指标的相关性分析：分析GD患者PBMC中miRNA-142-3P水平与GD患者临床资料之间的关系,miR-142-3P与年龄及性别无明显相关性(r=-0.108，P=0.524；r=0.059，P=0.730)；miR-142-3P与TRAb呈负相关(r=-0.364，P=0.027，图2)；miR-142-3P与TT4呈负相关(r=-0.437，P=0.007，图3)；miR-142-3P与TT3呈负相关(r=-0.337，P=0.042，图4)；miR-142-3P与FT3呈负相关(r=-0.392，P=0.017，图5)；miR-142-3P与FT4呈负相关(r=-0.326，P=0.049，图6)。

图2 miR-142-3p表达水平与TRAb的相关性

图3 miR-142-3p表达水平与TT4的相关性

图4 miR-142-3p表达水平与TT3的相关性

图5 miR-142-3p表达水平与FT3的相关性

图6 miR-142-3p表达水平与FT4的相关性

3.miR-142-3p诊断效能:ROC分析发现，miR-142-3p对GD有一定的诊断价值，ROC曲线下面积(AUC)=0.917(95% CI:0.806～1.028，图7)，通过ROC曲线确定的miR-142-3p诊断临界值为0.490，其敏感度为83.8%(95% CI:67.99%～93.81%)，特异性为93.3%(95% CI:68.05%～99.83%)。

图7 miR-142-3p诊断GD的ROC曲线

讨 论

Graves病每年发生率约为(20～30)/1000000，多在30～60岁发病[1]。Graves病发病机制尚未完全阐明，仅证实其是针对甲状腺滤泡细胞膜上促甲状腺激素受体(thyroid stimulating hormone receptor，TSHR)产生的抗体(TRAb)所引起的一种自身免疫性疾病。此种抗体是由B淋巴细胞所产生，但其具体作用机制不明，目前主流观点认为其主要由于抑制性T淋巴细胞功能降低所致，即免疫监护和调节功能的遗传性缺陷使患者在遭受精神刺激、感染等应激时，体内免疫稳定性被破坏，B细胞增生，在辅助T细胞的辅助下分泌大量自身抗体(TRAb)而致病[7，8]。

microRNA是在真核生物中发现的一类内源性的非编码小分子RNA，它能在细胞活动从分裂、增生到凋亡的各个阶段皆起到调控作用，其中在调控先天免疫及后天免疫中的作用尤为关键，可以通过影响DNA甲基化及TLR信号通道等多个环节控制各种免疫细胞亚群的分化[9]。许多研究显示了不同的miRNA在细胞中的生物学作用过程，包括细胞增殖，细胞凋亡和通过迁移下调各种靶向蛋白质编码的表达基因[10，11]。Liu 等[12]首次发现 miRNA的变化在Graves病患者体内有重要意义，其利用miRNA芯片技术评估患者和健康者外周血单核细胞(PBMC)内847种人类miRNA的表达，与健康者比较，Graves病患者PBMC内表达miRNA差异有意义的有16种，变化最明显的有miR-154、miR-376b、miR-431和miR-142-3P，该研究利用qRT-PCR技术检测GD患者和GD恢复期PBMC内miRNA 的水平，发现Graves病患者体内PBMC中的miR-154、miR-376b、miR-431、miR-142-3p 表达显著减少。本研究结果证实了在Graves病患者体内PBMC中miR-142-3p表达水平较正常对照组显著降低，这与其研究结果一致。

miR-142-3p分布于T细胞，有报道显示miR-142-3p是潜在的区分调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)与非Treg的miRNA标记。与正常CD4+T细胞比较，在Treg细胞中miR-142-3p表达水平下调[13]。Huang等[14]研究发现，miR-142-3p在T细胞不同亚群中的差异表达介导细胞间信号转导。miR-142-3p通过靶向CD4+CD25-T细胞和CD4+CD25+T细胞中的腺苷酸环化酶(AC) 9信使RNA负性调控cAMP的产生。而cAMP在B细胞中为诱导抗原刺激的增生和抗体产生提供了必要的信号[15]。本研究结果表明，Graves病患者外周血单个核细胞中miR-142-3p的表达水平下调，而miR-142-3P与TT3、TT4和TRAb呈负相关。笔者推测miR-142-3p表达下降在甲状腺功能亢进发病中的可能机制为：对AC9 mRNA的抑制减弱，导致AC9表达增加，从而使cAMP合成增加，B淋巴细胞增生，从而分泌大量抗体导致GD发生。

特定的miRNA失调与人类疾病有关，包括癌症、感染性疾病以及和机体免疫反应相关的疾病。这使得它们成为重要的致病因子以及这些疾病的潜在治疗目标。结合本研究结果，miR-142-3p的表达水平不仅在GD中显著减少、还与GD患者的血清甲状腺激素水平高低相关，笔者认为miR-142-3p也许可以成为Graves病诊断的生物学标志物和治疗新靶点。一般来说，ROC曲线下面积越大，诊断实验的鉴别能力越强，0.9以上表明诊断价值较高。而miR-142-3P在诊断Graves病中的ROC曲线下面积为0.917，表明miR-142-3p对于Graves病具有较高的诊断价值，当设置miR-142-3p水平在0.490时，诊断可有较高的敏感度及特异性。临床中常依据患者出现高代谢症状和体征，甲状腺明显肿大及血清TT4、FT4增高，TSH减低，TRAb阳性等可明确GD的诊断。

本研究结果提示在临床诊断中可以联合现有的指标，使GD诊断体系更加完善、全面而科学，为某些无明显临床表现及血清学现象的疑难病例诊断提供了一个辅助指标。目前GD的治疗主要有抗甲状腺药物、131I及手术治疗等，其药物不良反应及术后并发症都较难避免，且GD疗程较久容易复发。miR-142-3p的表达水平与Graves病相关，在疾病的发生、发展中可能起到重要作用,在治疗上也可作为临床疗效判断的一个标准。进一步研究其作用机制，有望为预防和治疗Graves病提供一个新靶点，增加miR-142-3p的表达可能是GD治疗的一种潜在策略，为新药的开发提供一个思路。