FOXQ1与E-cadherin蛋白在口腔鳞癌中的表达及临床意义

闫 冰 朴松林 杨海燕 元冬梅 沈禹辰 李吉辰

口腔颌面部恶性肿瘤是全球范围内10种最常见的肿瘤之一，其中以口腔鳞状细胞癌所占比例最高，约为90%以上[1]。在过去的几十年里，口腔鳞癌的发生率呈明显的上升趋势[2]。转录因子叉头框Q1(forkhead box Q1，FOXQ1)广泛存在于人体的多种组织和器官，具有促进上皮分化、参与细胞周期调节等多种生理功能，并与人类肿瘤的发生、发展和转移关系密切，但目前FOXQ1在口腔鳞癌中的表达情况及作用尚未明确[3]。上皮钙黏蛋白(epitheia cadherin，E-cadherin)目前被公认为是一类抑癌因子，其表达水平降低或缺失可作为肿瘤细胞出现上皮-间质转化(EMT)的一个关键性特征，与多种肿瘤的侵袭与转移具有相关性[4]。本研究通过免疫组化染色法检测FOXQ1和E-cadherin的表达情况，分析两者之间的相关性，探究两者在口腔鳞癌中的作用及临床意义。

对象与方法

1.实验对象:收集2013年4月～2016年10月间哈尔滨医科大学第一临床医学院病理科已确诊的口腔鳞癌组织石蜡标本作为研究对象。根据WHO病例分型,其中高分化口腔鳞癌51例，中、低分化口腔鳞癌18例，共69例，其中，男性39例，女性30例，患者年龄38～80岁，中位年龄为57岁。根据国际抗癌联盟(UICC)制定的TNM分类分期标准(2010)对临床分期进行分类：Ⅰ～Ⅱ期46例，Ⅲ～Ⅳ期23例。纳入本研究中的所有口腔鳞癌患者均已行手术治疗，且术前均未接受过放、化疗等相关治疗。从口腔颌面外科手术切取的唇、舌、牙龈、颊部及口底来源共32例正常口腔黏膜组织石蜡标本作为对照组。两组常规资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本实验已获得患者及家属的知情同意。

2.主要试剂：FOXQ1兔抗人多克隆抗体、E-cadherin兔抗人多克隆抗体、免疫组化试剂盒以及DAB显示剂盒等均购自北京博奥森生物技术有限公司。

3.实验方法：本实验应用SP方法，所有标本按4μm厚度作连续切片。将组织石蜡切片置于67℃烤箱中烤90min，脱蜡，PBS冲洗3min×3次。放置于3%H2O2室温下孵育10min，PBS 冲洗3min×3次。PBS浸泡5min。将切片浸泡于EDTA缓冲液，高压蒸汽锅行抗原修复，待压力锅喷气时，计时3min后于室温下自然冷却。PBS冲洗5min×3次。滴加FOXQ1多克隆抗体(1∶100)及E-cadherin多克隆抗体(1∶100)，于4℃恒温环境下过夜，蒸馏水冲洗5min 后，PBS冲洗3min×3次；滴加二抗工作液，37℃孵育30min；蒸馏水冲洗3min后，PBS 冲洗3min×3次；DAB试剂盒显色，蒸馏水冲洗终止显色反应。苏木精复染，蒸馏水充分冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。

4.结果判读：FOXQ1在口腔鳞癌组织中的阳性表达为细胞质被染出棕黄色颗粒，少量细胞核中表达。E-cadherin在正常口腔黏膜组织中的阳性表达为细胞膜与胞质被染出棕黄色颗粒。每张切片高倍镜下(×400)随机观察5个不重叠视野，每个视野各计200个细胞。采用双盲法，根据阳性肿瘤细胞率进行半定量分析，阳性细胞率以≤10%、10%～50%(含)、50%～80%、≥80%分别记为0、1、2、3分；根据染色程度进行评分：无染色、浅黄色、棕黄色、棕褐色分别记为0、1、2、3分；结果按两者的得分之积来判定结果：<3分计为阴性(-)，≥3分计为阳性(+)。

5.统计学方法：应用SPSS 20.0统计学软件对数据进行统计分析，采用χ2检验处理计数资料，Spearman法行等级相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.FOXQ1与E-cadherin在口腔鳞癌及正常口腔黏膜组织中的表达比较:FOXQ1在口腔鳞癌中的表达位置主要为细胞质，可见癌细胞被染成棕黄色至棕褐色，少见细胞核表达，而在正常口腔黏膜组织中表现为表达减少甚至缺失。E-cadherin在正常口腔黏膜组织中的表达位置主要为细胞膜与细胞质中，亦都被染成棕色，而在口腔鳞癌组织中低表达或不表达(图1)。FOXQ1在口腔鳞癌组织中阳性表达率为71.01%(49/69)，E-cadherin则为27.53%(19/69)，正常口腔黏膜组织中阳性表达率分别为18.75% (6/32)、84.37% (27/32)，两者间比较差异有统计学意义(P<0.01),详见表1。

图1 FOXQ1和E-cadherin在口腔鳞癌及正常口腔黏膜组织中的表达比较(×400)A.FOXQ1在正常口腔黏膜组织中的表达；B.FOXQ1在高分化口腔鳞癌组织中的表达；C.FOXQ1在中分化口腔鳞癌组织中的表达；D.FOXQ1在低分化口腔鳞癌组织中的表达；E.E-cadherin在正常口腔黏膜组织中的表达；F.E-cadherin在高分化口腔鳞癌组织中的表达；G.E-cadherin在中分化口腔鳞癌组织中的表达；H.E-cadherin在低分化口腔鳞癌组织中的表达

表1 FOXQ1与E-cadherin在口腔鳞癌及正常口腔黏膜组织中的表达

与正常口腔黏膜组织比较，*P<0.01

2.口腔鳞癌组织中FOXQ1及E-cadherin的表达与临床病理参数的关系:在口腔鳞癌组织中，FOXQ1的表达与患者的年龄、性别、吸烟史及肿瘤直径无明显相关性(P>0.05)，与口腔鳞癌的组织分化程度及TNM分期呈正相关(P<0.05)，E-cadherin的表达与上述结论一致，详见表2。

表2 FOXQ1与E-cadherin的表达与口腔鳞癌临床病理参数的关系

3.口腔鳞癌组织中FOXQ1与E-cadherin表达的相关性:FOXQ1阳性表达的49例口腔鳞癌组织标本中，E-cadherin阳性表达为10例，阴性表达为39例；FOXQ1阴性表达的20例口腔鳞癌组织标本中，E-cadherin阳性表达为9例，阴性表达为11例。以Spearman法行等级相关性分析，口腔鳞癌组织中FOXQ1与E-cadherin的表达呈明显负相关(r=-0.250，P<0.05),详见表3。

讨 论

FOXQ1属于叉头框(forkhead box，FOX)转录因子家族中的一员。FOXQ1基因位于人类染色体6p25.3，由2319个碱基对(bp)组成，FOXQ1蛋白含有403个功能氨基酸[11]。FOXQ1通过作用于靶基因启动子区域的GC盒等核心元件，影响基因转录从而发挥生物学效应。以往的研究证实FOXQ1的过度表达与肝细胞癌、肺癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌和食管鳞癌等多种癌症的不良预后和远处转移密切相关[12～17]。Gao等[18]以FOXQ1高表达的人卵巢癌细胞系SKOV3为模型，利用shRNA敲除方法沉默FOXQ1的表达后发现细胞周期调节因子的表达受到影响，并使上皮细胞标志物上调、间充质细胞标志物下调，导致其肿瘤细胞生长周期出现减缓现象，从而抑制细胞增殖，减少细胞运动与侵袭，这些结果提示FOXQ1的表达对维持卵巢癌细胞的增殖、运动、侵袭和EMT是必不可少的。

表3 FOXQ1与E-cadherin在口腔鳞癌组织中表达的相关性

Zhang等[19]和Fan等[20]研究发现,FOXQ1的异位表达促进了细胞在体外的迁移和侵袭，增强了乳腺上皮细胞在体内的肺转移，并触发了明显的EMT，其作用机制可能为FOXQ1蛋白直接作用于E-cadherin的启动子区域，从而抑制E-cadherin的表达，并参与了TGF-b1诱导的EMT过程。Qiao等[21]研究发现FOXQ1在多种结肠癌细胞株中的异位表达不仅能诱导EMT的发生，并能诱导这些细胞产生化疗药物耐药性。Zhan等[22]研究结果显示，FOXQ1在胰腺癌组织中的表达上调，其主要在胰腺癌细胞质中表达，在细胞核中表达较少。胰腺癌组织中FOXQ1表达水平显著高于癌旁组织，并与肿瘤分化程度呈正相关，这也与笔者的实验结果相一致。本研究中FOXQ1在口腔鳞癌组的阳性表达率与对照组差异有统计学意义(71.01%、18.75%，P<0.01)，初步推断FOXQ1在口腔鳞癌中扮演着重要角色。FOXQ1与口腔鳞癌的组织分化程度及TNM分期相关则提示其在口腔癌的发展中起到一定作用。

肿瘤细胞向远处器官转移是人类肿瘤最常见的死亡原因。上皮-间充质转化(EMT)是一个促进细胞迁移和侵袭的动态过程。上皮细胞可丧失极性转化为间质细胞表型，细胞黏附性连接中断，从而使肿瘤细胞具备了迁移和侵袭能力，引起肿瘤的远处转移[5]。因此，EMT相关转移是肿瘤研究的一个重要领域。E-cadherin是一类钙依赖性跨膜糖蛋白，其N-端位于细胞外而C-端位于细胞内，其编码基因(CDH1)位于人类染色体6q22.1[6，7]。E-cadherin可以介导同种上皮细胞之间的黏附作用，起着维持上皮组织结构完整的重要作用[8]。如果E-cadherin在组织中失活或是表达水平降低，细胞间的黏附力会明显下降，进而有利于肿瘤细胞的侵袭与转移。反之，若E-cadherin 在组织中的表达水平升高可增强细胞间的黏附，肿瘤细胞的侵袭力被减弱，抑制其浸润转移[9]。EMT的一个标志性特征是E-cadherin的表达抑制，E-cadherin也被认为是EMT的关键开关[10]。本研究中E-cadherin在正常黏膜组织中的阳性表达率为84.37%，但仅有27.53%口腔鳞癌标本呈阳性表达，两者之间比较差异有统计学意义(P<0.01)，提示E-cadherin与口腔鳞癌的侵袭与转移有关。

综上所述，在口腔鳞癌的发病过程中，FOXQ1呈高表达水平，而E-cadherin的表达情况则呈相反趋势，二者呈明显负相关(r=-0.250，P<0.05)，FOXQ1与E-cadherin共同参与口腔鳞癌的发展和转移。因此，FOXQ1与E-cadherin的联合检测可作为口腔鳞癌早期诊断及判断预后的生物学指标，FOXQ1有望成为口腔鳞癌治疗的新靶点。但FOXQ1和E-cadherin二者在口腔鳞癌中的作用机制尚需开展进一步探究。