用1H-MRS评价利拉鲁肽对肥胖小鼠脂质代谢影响的研究

辛 颖 闫 爽

肥胖作为一种由遗传、环境、肠道菌群等多种因素作用的慢性代谢性疾病，目前已呈全球流行趋势。最新研究资料显示,截至2015年，全球约有22亿超重/肥胖患者，中国达5700万，仅次于美国，位居世界第2位[1]。大量研究证实，肥胖与糖尿病、心血管疾病、肿瘤等慢性疾病的发生和死亡密切相关。因此，治疗肥胖症及其相关的健康问题对卫生保健系统具有重大的影响[2～4]。

哺乳动物体内有棕色脂肪组织 (brown adipose tissue, BAT)、白色脂肪组织 (white adipose tissue, WAT)和米色脂肪组织(beige adipose tissue，BAT) 3种。肥胖主要表现为白色脂肪数量的增多和体积的增大，并聚集于腹腔和皮下，以甘油三酯(triglyceride,TG)的形式储存过剩的能量[5]。甘油三酯在脂肪组织与非脂肪组织等部位的过度蓄积，可导致脂肪组织缺氧、慢性炎性反应以及脂肪因子分泌破坏，继发全身胰岛素抵抗与脂质代谢紊乱,因此而诱发糖尿病、非酒精性脂肪肝病(NFALD)等[6,7]。

利拉鲁肽作为一种人工合成的胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide -1,GLP-1)的类似物，因其独有的促胰岛素分泌(葡萄糖浓度依赖性)、改善胰岛β细胞功能等特性，目前广泛应用于2型糖尿病的治疗[8]。近年来，利拉鲁肽作为一种减重药物为人们所熟知。因GLP-1受体广泛分布在人体的各个部位，包括胰腺、胃、十二指肠、肺、心脏、肝脏、肾脏、脑及内皮细胞等[9]。而利拉鲁肽可通过与分布于脑干、下丘脑和杏仁体的GLP-1受体结合，发挥中枢性抑制食欲作用，同时抑制胃肠蠕动及分泌功能，延缓胃内容物排空，从而达到减重的效果[10]。2014年美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration of the United States,FDA)批准利拉鲁肽用于慢性体重管理，利拉鲁肽3.0mg/d成为肥胖人群尤其伴有高血压、糖尿病、血脂代谢异常人群减重的辅助治疗手段[11]。最近的大量临床研究和动物实验还证实了GLP-1可通过减轻体重，改善胰岛素抵抗和糖代谢，进而改善肝脏脂质沉积[12]。间断性禁食(intermittent fasting，IF)是一种新型的通过饮食干预减重的方法，主要包括5∶2饮食及隔日禁食，本研究采用隔日禁食(alternate day fasting，ADF)的方式，即正常饮食1日，然后禁食1日，如此循环[13]。

本研究采用氢质子磁共振波谱成像(proton magnetic resonance spectroscopy,1H-MRS)技术，经病理对照研究证实，1H-MRS不仅是活体下测量体内TG含量最准确、最可靠的影像学手段，还是对非酒精性脂肪肝定性和定量有效的方法[14,15]。本研究主要对C57BL6小鼠进行高脂肥胖小鼠造模，探讨利拉鲁肽的减重效果，及对小鼠体内不同部位、不同性质脂肪内甘油三酯含量的变化情况，以及与严格饮食控制即隔日禁食法干预比较，利拉鲁肽对脂肪组织代谢的影响是否完全依赖于体质量减轻。

材料与方法

1.材料：SPF级C57BL6雄性小鼠 32只, 6周龄，体质量约23±10g,购自北京维通利华实验动物中心。利拉鲁肽(诺和力) 购自丹麦诺和诺德公司;小动物9.4T MR购自德国Bruker PharmaScan公司；小鼠正常饲料D12492、高脂饲料D12450B购自博泰宏达生物有限公司。

2. 实验方法:(1)肥胖小鼠模型建立及干预:将6周龄清洁级C57BL6雄性小鼠32只,随机分为4组，每组8只，其中一组给予正常饲料(D12450B，10kcal%脂肪)喂养，其余3组给予高脂饲料(D12492，60kcal%脂肪)喂养，进行肥胖小鼠造模。8周后，与正常饲料喂养组比较，高脂饲料喂养组平均体质量增长超过30%，提示肥胖小鼠造模成功。将成功造模后的高脂饲料喂养组随机分为利拉鲁肽(GLP-1)组、隔日禁食(ADF)组和高脂对照(HFD)组, GLP-1组和HFD组分别继续给予高脂饮食，ADF组与正常对照(Control)组给予普通饲料喂养。GLP-1组每日皮下注射利拉鲁肽 0.4mg/(kg·d)，ADF组为每隔24h给予正常饲料，期间自由饮水。所有小鼠饲养于SPF级动物实验室，标准鼠笼饲养,每笼4～5只,温度 20～25℃,湿度50%～60%，动物室内明暗各12h左右。(2)1H-MRS测定肩胛间区棕色脂肪、腹股沟区白色脂肪及肝脏内甘油三酯(triglyceride, TG)含量:每组小鼠8只,4组共32只，扫描晨起禁食, 所有1H-MRS采集均在9.4 T MicroMR成像设备(Bruker PharmaScan，德国)上完成。扫描期间采用吸入麻醉剂异氟烷，与氧气混合后诱导剂量为5%，维持剂量为1%～2%，同时连接呼吸门控监视呼吸节律及幅度，呼吸频率保持25～35次/分，并予以保温。采集1H-MRS运用点分辨自旋回波波谱技术(point-resolved echo spin spectroscopy，PRESS)，体素为1.5mm×1.5mm×1.5mm～3.0mm×3.0mm×3.0mm，先取俯卧位，体将表面线圈至于肩胛间区，再取仰卧位，将表面线圈置于下腹部生殖腺周围及肝脏左叶，避开大血管部位。波谱数据分析时，设定4.7ppm位置水峰下面积为1，所有其他峰的积分值都随之标准化，甘油三酯(triglyceride,TG)峰位于1.2ppm处。按下列公式计算脂肪含量： TG含量=TG峰下面积/(水峰下面积+TG峰下面积)×100%。

结 果

1.4组小鼠体质量随时间变化趋势比较：干预前各组小鼠体质量差异无统计学意义，随喂养时间的延长，各组小鼠平均体质量均呈明显升高的趋势(P<0.05)，详见图1。干预16周末，GLP-1组小鼠平均体质量明显低于HFD组(P=0.009)，而高于对照组(P=0.011)，差异有统计学意义(P<0.05)。4组小鼠干预16周后，ADF组小鼠平均体质量最低，详见图2、表1。

图1 4组小鼠造模及干预期间体质量变化

图2 干预16周末4组小鼠体质量比较

表1 干预16周末4组小鼠体质量及1H-MRS下各部位TG含量比较

与HFD组比较,*P<0.05;与ADF组比较,ΔP<0.05

2.4组小鼠肩胛部棕色脂肪TG平均含量：由低到高分别是对照组，ADF组，GLP-1组和HFD组；各组间比较差异有统计学意义，详见表1、图3。

图3 干预16周末4组小鼠肩胛间区棕色脂肪TG含量比较

3.肝脏TG含量：4组小鼠肝脏TG平均含量由低到高分别是对照组， GLP-1组，ADF组和HFD组，GLP-1组和HFD组间比较差异有统计学意义(P=0.045)，详见表1、图4。

图4 干预16周末4组小鼠肝脏TG含量比较

4.腹股沟部位白色脂肪TG含量：4组小鼠腹股沟白脂肪TG平均含量由低到高分别是对照组，ADF组， GLP-1组和HFD组，与GLP-1组小鼠比较，对照组小鼠腹股沟白脂肪TG平均含量明显降低(P=0.002)，HFD组小鼠腹股沟白脂肪TG平均含量明显升高(P=0.015)，详见表1、图5。

图5 4组小鼠肝脏部位1H-MRS图像

图6 干预16周末4组小鼠腹股沟区白色脂肪TG含量比较

讨 论

目前随着全球肥胖人群的不断增长，肥胖的预防和控制越来越受到人们的关注。肥胖所引发的胰岛素抵抗、血脂代谢异常、慢性炎性反应是其引起的相关慢性疾病发生及发展的重要原因。甘油三酯(TG)在体内沉积部位包括脂肪组织与非脂肪组织(如肝脏)两部分，因此脂肪组织可与肝脏相互联系，通过调节游离脂肪酸水平，合成与释放多种脂肪细胞因子来控制全身的脂质代谢[16]。

利拉鲁肽作为一种人工合成的GLP-1受体激动剂，与人体内GLP-1的同源性达97%，目前研究表明人体内GLP-1可抑制摄食中枢，延缓胃排空，从而达到抑制甘油三酯吸收的效果，因此人体内GLP-1在减低体重的同时可改善脂质代谢[17]。关于人工合成GLP-1受体激动剂的研究亦表明，GLP-1受体激动剂可能通过抑制脂肪的合成及刺激脂肪酸氧化两个方面来改善肝脏的脂质代谢[18]。虽然目前大量研究结果表明GLP-1可影响体内脂肪酸代谢，然而机制仍未完全明确。

自2010年Gupta等首次发现人类原代肝细胞上存在GLP-1受体,之后陆续有临床、动物及细胞研究证明了GLP-1能改善脂质在肝脏内的沉积,但具体机制尚不明确。研究发现，作为介导细胞间黏附和参与基因表达的β-catenin分子对GLP-1的生成和功能发挥起着重要作用，其重要机制除了包括wnt信号途径外，还可能与迁移相关信号通路PI3K/Akt、MAPKs之间存在密切关系。β-catenin作为wnt信号途径的核心分子，越来越多的研究表明，其与肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪性肝病以及代谢综合征的发生、发展也密切相关。虽然GLP-1降脂机制仍不十分清楚，但其降脂效果得到了公认，本研究意在通过小鼠高脂模型研究GLP-1对小鼠机体不同部位脂肪含量的影响，验证其通过多途径影响脂代谢的假说。

本研究通过对C57BL6小鼠建立肥胖模型，以FDA建议的3.0mg/d的减重剂量换算成小鼠给药剂量0.4mg/(kg·d)，并分别设置普通对照组，高脂对照组及隔日禁食组，隔日禁食组被动性减少小鼠摄食量，导致小鼠摄入的能量显著降低，从而达到强制性减重的目的。干预16周末，通过1H-MRS技术分别对4组小鼠进行扫描，测量定量肩胛部位棕色脂肪，腹股沟区白色脂肪及肝脏等3个部位的甘油三酯含量。

本研究结果显示，利拉鲁肽有显著降低体质量及改善白色脂肪脂质代谢的作用，但通过与隔日禁食组比较后发现，额外的体质量减低并没有给隔日禁食组带来白色脂肪脂质代谢方面的获益，这说明利拉鲁肽在通过降低体质量改善脂质代谢的同时，还有其他不依赖于体质量减轻而影响脂质代谢的途径。有研究显示，GLP-1受体激动剂可能通过MAPK通路，促进脂肪酸氧化，逆转肝脏脂肪变性，还可能通过增强肝细胞自噬作用，减少肝脏脂肪沉积，并通过增加沉默调节蛋白(SIRT1)的表达，抑制肝细胞内质网应激，减少肝脏脂质沉积[19，20]。近年来研究发现，哺乳类动物和啮齿类动物的肝脏上均存在 GLP-l受体[21]。因此，笔者认为利拉鲁肽改善肝脏脂质代谢是一个多途径、多通路的复杂的过程，不单纯依赖于体重的减轻，但这一过程还需要更多的基础性研究加以佐证。