TMAO通过PI3K/AKT/mTOR信号通路影响心脏原代成纤维细胞的增殖

赵 雨 刘向东 吕家顺 张庆勇

在人体摄入富含卵磷脂、胆碱、L-肉碱的高脂营养物质后，经某些特定的肠道微生物酶复合物的分解代谢，首先产生三甲胺(trimethylamine，TMA)。TMA进入门静脉系统后，经肝脏含黄素单氧化酶(flavin-containing monooxygenases)氧化，即产生TMAO[1]。TMAO除了与慢性肾脏疾病、2型糖尿病及肥胖关系密切外，还参与心血管代谢性疾病，如心肌肥大、心脏纤维化。TMAO的产生、代谢过程与心血管疾病的发生高度相关，可作为心血管疾病治疗的潜在靶点[2,3]。

心脏间充质细胞，也被简称为“成纤维细胞”，是心脏中分布最广的细胞类型之一[4]。哺乳动物心脏的正常功能主要由心肌细胞和心脏成纤维细胞(CF)相互协调、相互作用来维持的，这两种细胞占心脏细胞的90%[5]。在人类心脏中，心脏成纤维细胞占60%～70%，是细胞外基质的主要来源，除在细胞和非细胞组分间的机械、化学、电信号的转导中发挥作用外，在高血压、心肌梗死及心力衰竭发生时的心脏重构过程中也发挥重要作用[6]。肠道菌群代谢对人体的影响日益受到关注，但其代谢产物是如何影响人体病理生理进程的，是否会对心脏重构造成影响，尚缺乏足够研究，本研究旨在探索TMAO影响心脏成纤维细胞增殖的可能作用机制。

材料与方法

1.材料: 小鼠原代心脏成纤维细胞购自上海拜力生物科技有限公司; 一抗抗体PI3K(phosphatidyl inositol 3-kinase,#4292)、p-PI3K(Tyr458,#4228)、AKT(protein kinase B,#9272)、p-AKT(Thr308,#13038)、mTOR(mammalian target of rapamycin, #2972)、p-mTOR(#2974)、GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,#5174)购自美国Cell Signaling Technology 公司; 二抗山羊抗兔购自北京博奥森公司;DMEM(dulbecco′s modified eagle medium)、胎牛血清购自美国 Gibco 公 司; 氧化三甲胺(TMAO)、LY294002(PI3K抑制剂)、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide， DMSO)购自美国 Sigma 公司; BCA 蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术公司; 增强型化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL) 显影液购自美国Thermo公司; PowerPac Universal 电泳装置购自美国 Bio-Rad 公司; EPOCH 型酶标仪购自美国BioTek公司。

2.方法: (1) 细胞培养:在5% CO2、37℃的培养条件下培养原代心脏成纤维细胞。培养液为含10%胎牛血清的DMEM。待细胞长满后使用PBS 2毫升/次冲洗 2次，然后加入 2ml 0.25%的胰酶消化1min，再加入2ml培养液终止消化。使用枪头将贴壁细胞吹打下来，将细胞悬液吸入15ml离心管以 0.9×g速度离心3min，离心后弃去上清，将细胞混匀后按以5×105细胞密度接种于6孔板中。(2) 细胞处理: 浓度梯度组：分别用含0、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0μmol/L TMAO的培养基培养原代心脏成纤维细胞，48h后收集细胞；时间梯度组：分别用TMAO处理原代心脏成纤维细胞0、15、30、60min；抑制剂组：在用TMAO处理细胞前，加入PI3K抑制剂LY294002 10μmol/L预处理细胞30min。(3)Western blot法检测蛋白表达: 处理结束后，每孔加入100μl 含1%苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)和10%磷酸酶抑制剂的细胞裂解液裂解细胞。待细胞充分裂解后离心，取上清后使用BCA检测试剂盒进行蛋白定量，浓度调齐后煮沸15min。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 跑完后用二氟乙烯(polyvinylidene floride，PVDF)膜进行转膜。然后40ml TBST中加入2g牛奶混匀后于室温下将膜封闭2h， 一抗PI3K、p- PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、GAPDH 4℃ 孵育过夜。TBST 10分钟/次将膜洗涤3次。室温下孵育二抗 2h，TBST 10分钟/次将膜洗涤 3 次。使用 Image Quant LAS 4000 mini 进行显影。

结 果

1.在用不同浓度的TMAO处理心脏成纤维细胞后，各蛋白表达量的变化：Western blot法检测结果表明，随着TMAO浓度不断提高，p- PI3K、p-AKT、p-mTOR的表达量呈增加趋势，其中p- PI3K 在TMAO为10μmol/L 的时候表达量最高，p-AKT和p-mTOR在TMAO为25μmol/L 的时候表达量最高。

2.用浓度为10 μmol/L的TMAO，分别处理心脏成纤维细胞0、15、30、60min后，各蛋白表达量的变化：随着培养时间延长，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表达量呈增加趋势，其中p- PI3K 在培养30min的时候表达量最高，p-AKT和p-mTOR在培养60min的时候表达量最高。

3.PI3K/AKT/mTOR信号通路各蛋白表达量的变化：用PI3K抑制剂LY294002预处理细胞30min后，再用10μmol/L 的TMAO处理细胞后，与单纯用TMAO处理的细胞比较，同时用PI3K抑制剂处理组，其p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表达量明显减少。

讨 论

一直以来，饮食都被认为与心血管疾病的发生有关，而近几年的研究也表明，营养摄入、肠道菌群代谢参与宿主心血管疾病的发生、发展。此外，宿主体内微生物产生的多种代谢物，如氧化三甲胺、短链脂肪酸(short chain fat acids,SCFAs)和次级胆汁酸(secondary bile acids)，也会参与心血管疾病的病理生理过程。尽管一些强效降脂药已广泛应用于临床，心血管疾病位居是发达国家人口死亡原因之首，因此进一步明确心血管疾病治疗的靶点势在必行[7]。近10年来的研究发现，氧化三甲胺(TMAO)、短链脂肪肪酸(SCFAs)和次级胆汁酸在心血管疾病的发展中发挥特定作用，尽管一些大型抗生素治疗试验未能发现可以让心血管疾病患者获益，但目前心血管药物研究俨然已进入以肠道菌群代谢产物为靶点的新领域[8,9]。有研究发现，TMAO可以通过TGF-β/SMAD3信号通路促进心脏和肾脏的纤维化[10]。

图1 TMAO不同浓度处理后，信号通路各蛋白表达量的变化A.Western blot法检测不同浓度的TMAO处理心脏成纤维细胞后各磷酸化蛋白表达的变化；B.p- PI3K/PI3K；C.p-AKT/AKT；D.p-mTOR/mTOR

图2 TMAO不同时间处理后，信号通路各蛋白表达量的变化A.Western blot法检测用浓度为10μmol/L的TMAO处理心脏成纤维细胞不同时间后各磷酸化蛋白表达量的变化;B.p-PI3K/PI3K;C.p-AKT/AKT;D.p-mTOR/mTOR

图3 PI3K抑制剂LY294002预处理后，信号通路各蛋白表达量的变化A.Western blot法检测经PI3K抑制剂LY294002预处理心脏成纤维细胞后各磷酸化蛋白表达的变化；B.p-PI3K/PI3K;C.p-AKT/AKT;D.p-mTOR/mTOR。与抑制剂预处理组比较，*P<0.05

在健康的心脏中，成纤维细胞是参与心脏结缔组织形成和维持的主要细胞类型。心脏结缔组织包含细胞和非细胞成分，其中的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)可以为心肌细胞提供稳定的结构，使心脏成为一个整体[6]。而纤维化是许多常见心血管疾病诸如心肌梗死和高血压的自然后遗症，并且通常加剧心血管疾病和心力衰竭的进展，此外，心脏局部瘢痕和散在纤维化也是扰乱正常电生理活动、导致心律失常发生的独立因素，但目前还没有专门针对纤维化的治疗方法[11]。因此，控制心脏成纤维细胞和肌成纤维细胞增殖、表型转化和基质合成这些行为的调节过程和细胞内信号转导途径代表了抗纤维化治疗发展的研究重点[12]。PI3K/AKT/mTOR信号通路可通过多种潜在机制影响细胞生长、细胞增殖、细胞存活及糖吸收[13]：PI3K通过产生三磷酸磷脂酰肌醇引起信号级联放大反应，并激活AKT；AKT可以对胞内胞外多种刺激作出反应，是细胞存活重要的调节器；mTOR作为一种相对分子质量为289000的非典型丝苏氨酸蛋白激酶，可调节细胞生长，主要受PI3K/AKT/mTOR信号通路的调控[14]。

本研究发现，TMAO增加了PI3K/AKT/mTOR细胞增殖信号通路中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表达量，说明TMAO可能通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路影响心脏成纤维细胞的增殖。为了进一步验证，笔者使用了PI3K抑制剂LY294002将PI3K的活性抑制后，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表达量均明显降低，即使加入TMAO处理，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表达量也未发生明显升高，进一步表明了TMAO可以通过PI3K/AKT/mTOR信号通路发挥作用。

综上所述，本研究发现TMAO可以激活PI3K/AKT/mTOR信号通路，并可能通过该信号通路促进心脏成纤维细胞的增殖，这有助于进一步了解TMAO促进心脏纤维化的分子机制，而TMAO促纤维化是否还有其他分子机制参与，尚需进一步探究。