脑栓通胶囊对动脉粥样硬化小鼠血脂水平的影响*

刘婷婷 孙芳玲 赵学庆 郑文荣 田 欣 祝自新 郭德玉 王 文

(1.首都医科大学宣武医院实验动物室，北京市老年病医疗研究中心，北京 100053)(2.北京理工大学生命学院，北京 100081)

脑栓通胶囊由蒲黄、赤芍、郁金、漏芦、天麻五味药材组成，可以起到活血通络、祛风化痰的作用，是临床治疗缺血性中风病常用的中成药。君药蒲黄活血化瘀、通达血脉；臣药赤芍凉血行血、祛瘀破积；郁金行气解郁，清气化痰、解气痰火郁遏；佐药天麻熄风止痉、通络化痰；漏芦清解郁热、祛瘀通脉。临床治疗效果显示其可以改善脑梗死患者运动功能，降低炎症反应，改善脑梗死患者脑血流储备能力及血管弹性功能[1-6]，虽然脑栓通胶囊在临床应用过程中具有良好的治疗效果，但是其治疗作用的相关机制并不清楚，且少有相关的基础理论研究报道。ApoE基因是一种负责包装、运输和处理胆固醇与其他脂类的载脂蛋白，可调节脂质代谢，维持胆固醇代谢平衡，是脂类代谢和心血管疾病的决定因子，缺乏ApoE会引起血浆内富含胆固醇的物质累积。ApoE基因敲除小鼠于1992年培育成功[7-8]。这种实验小鼠可以在正常或高脂饮食喂养的情况下，形成严重的高脂血症并引发动脉粥样硬化病灶。ApoE-/-小鼠的动脉粥样硬化形成呈慢性、自发性、进展性、连续性、广泛性，在很大程度上与人类动脉粥样硬化形成相似，是探讨动脉粥样硬化发生发展的可靠模型[9]。本课题采用动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠模型，研究脑栓通胶囊对血脂水平的调节作用，探讨脑栓通胶囊治疗缺血性脑卒中的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SPF级别6周龄雄性ApoE-/-小鼠(品系：C57BL/6 J)，北京大学医学部(实验动物科学部)提供。动物生产许可证：SCXK(京)2016-0010，合格证号NO.11804700015074，动物使用许可证：SYXK(京)2015-0016。

1.2 药物与试剂

脑栓通胶囊由广东华南药业有限公司生产(国药准字Z20040093)。总胆固醇(TC)测试盒(A111-1)、甘油三酯(TG)测试盒(A110-1)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)测试盒(A112-1)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)测试盒(A113-1)购自南京建成生物工程研究所。

1.3 主要仪器

全波长酶标仪(Multiskan Spectrum，美国Thermo Fisher公司)。

1.4 方法

1.4.1实验动物分组及给药：ApoE-/-小鼠适应性饲养1周后，给予高脂饮食喂养(含0.15%胆固醇、21%脂肪)，建立动脉粥样硬化模型[10-11]，在喂养过程中，随机抽取小鼠，取其主动脉弓，进行油红O染色，观察有无斑块形成的情况，判断ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化发展程度确定造模是否成功。高脂饲料喂养12周后，随机分为模型组、低剂量组和高剂量组，每组7只小鼠。低剂量组给予脑栓通胶囊0.5 g/kg体质量，高剂量组给予脑栓通胶囊1.0 g/kg体质量，对照组给予等量的蒸馏水，连续给药12周，每天给药1次。

1.4.2血样采集及生化分析：小鼠用10%水合氯醛麻醉后，剪开下腹腔，暴露腹主动脉，取血0.5～1.0 mL。室温静置2 h。放入离心机，3 000 r/min，4 ℃离心20 min，取上清，检测TC、TG、HDL-C、LDL-C等生化指标。

1.5 统计方法

2 结果

2.1 脑栓通胶囊对ApoE-/-小鼠总胆固醇含量的影响

总胆固醇是指血液中所有脂蛋白所含胆固醇的总和，是反应血脂水平的重要指标之一。结果显示，与模型组比较，脑栓通小剂量组和脑栓通大剂量组的TC水平显著降低且有统计学意义(P<0.01,n=7)(图1)。

图1 脑栓通胶囊(NST)对ApoE-/-小鼠血清中总胆固醇含量的影响注：与模型组相比，**P<0.01Fig.1 Effect of Naoshuantong capsule (NST) on serum total cholesterol (TC) in ApoE-/- miceNote: compared with the model group,**P<0.01

2.2 脑栓通胶囊对ApoE-/-小鼠甘油三酯含量的影响

甘油三脂是长链脂肪酸和甘油形成的脂肪分子，是人体含量最多的脂类，其水平高低与动脉粥样硬化程度密切相关[12]。根据血清生化分析结果显示(图2)，与模型组相比，脑栓通胶囊小剂量组和脑栓通胶囊大剂量组均能显著降低血浆中的TG的含量，差异有统计学意义(**P<0.01,n=7)。

图2 脑栓通胶囊(NST)对ApoE-/-小鼠血清中甘油三酯含量的影响注：与模型组相比，**P<0.01Fig.2 Effect of Naoshuantong capsule (NST) on serum triglyceride (TG) in ApoE-/- miceNote: compared with the model group,**P<0.01

2.3 脑栓通胶囊对ApoE-/-小鼠低密度脂蛋白胆固醇含量的影响

低密度脂蛋白胆固醇高于正常水平时，易聚集于大中动脉分支及弯曲处，与动脉粥样硬化的生成有直接关系[13]。与模型组比较，脑栓通胶囊小剂量组LDL-C水平显著降低，有统计学差异(**P<0.01，n=7)；脑栓通胶囊大剂量组LDL-C水平显著降低，有统计学差异(***P<0.001，n=7)(图3)。

图3 脑栓通胶囊(NST)对ApoE-/-小鼠血清低密度脂蛋白胆固醇含量的影响注：与模型组相比，**P<0.01，***P<0.001Fig.3 Effect of Naoshuantong capsule (NST) on serum low density lipoprotein-cholesterol (LDL-C) in ApoE-/- miceNote: compared with the model group,**P<0.01,***P<0.001

2.4 脑栓通胶囊对ApoE-/-小鼠高密度脂蛋白胆固醇含量的影响

高密度脂蛋白胆固醇是一种抗动脉粥样硬化的脂蛋白，可将胆固醇从肝外组织转运到肝脏进行代谢，由胆汁排出体外[14]。实验结果表明(图4)，与模型组比较，脑栓通胶囊小剂量组和脑栓通胶囊大剂量组的血清HDL-C水平没有明显差异(P>0.05,n=7)。

图4 脑栓通胶囊对ApoE-/-小鼠血清高密度脂蛋白胆固醇含量的影响Fig.4 Effect of Naoshuantong capsule (NST) on serum high density lipoprotein-cholesterol (HDL-C) in ApoE-/- mice

3 讨论

动脉粥样硬化是脑卒中及外周血管疾病的主要病理基础，而脂质代谢紊乱是动脉粥样硬化的一个重要因素。高血脂症中大量脂质进入血管内膜下引发免疫炎症反应，导致血管内皮细胞损伤，血浆脂蛋白进入血管内膜，引起巨噬细胞吞噬反应、血管平滑肌细胞增生，形成斑块，斑块堵塞脑血管，则引发脑卒中[15]。脑栓通胶囊是临床用于治疗脑卒中的中药复方制剂，且疗效显著，但其具体的作用机理并不清楚。ApoE蛋白是清除乳糜微粒和极低密度脂蛋白受体的配体。存在于多种脂蛋白颗粒中，可运载内源性和外源性胆固醇，在动脉粥样硬化中起保护作用，因此缺乏ApoE则导致血液循环中富含胆固醇的物质积累，形成动脉粥样硬化。ApoE基因缺陷小鼠是由美国洛克菲大学和北卡罗莱那大学两处实验室运用胚胎干细胞基因敲除技术，于1992年培育成功[7-8]。因为该小鼠能在自然饮食条件下形成动脉粥样硬化，并且其病理改变与人类极为相似，甚至能形成纤维斑块，广泛地用于动脉粥样硬化的药效与机制研究[16-17]。本实验通过对动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠血脂水平的检测，探讨脑栓通治疗脑卒中的相关机制。TC是指血液中各脂蛋白所含胆固醇的总和，结果显示，脑栓通胶囊小剂量组和脑栓通胶囊大剂量组均可降低TC含量。低密度脂蛋白以胆固醇为内核，含4 536个氨基酸残基的载脂蛋白B100覆盖于表面，借助非极性的疏水基团与内核相连。当血浆LDL水平高于正常时会集聚于大中动脉分支弯曲处，进入损伤血管内膜，氧化生成Ox-LDL。Ox-LDL可对内皮细胞结构和功能的完整性造成破坏，促进动脉内膜的脂质沉淀，是动脉粥样硬化的关键启动因素[18-20]。研究结果显示，脑栓通小剂量组和脑栓通大剂量组可以显著降低LDL-C的水平。此后，研究人员又进一步观察了脑栓通胶囊对HDL-C的调节作用。HDL-C参与胆固醇逆向转运，将巨噬细胞、血管平滑肌等肝外组织细胞内胆固醇携带至肝脏转化为胆汁酸或直接通过胆汁酸排出体外，从而减轻整体的脂质负荷[13, 21]，所以普遍认为HDL-C具有抗动脉粥样硬化作用。但HDL-C具有双重作用，其在生理状态下，HDL的抗动脉粥样硬化功能占优势，处于主导地位。而在病理状态下，HDL-C的结构成分会发生病理变化，其理化性质及功能状况相应改变，使HDL-C抗动脉粥样硬化作用减弱甚至逆转。本研究结果显示，与模型组相比，脑栓通胶囊给药组的HDL-C水平没有显著增加或减少，无统计学差异。提示脑栓通胶囊用于治疗动脉粥样硬化过程中可能和HDL-C水平无关。TG是血浆中各脂蛋白所含脂肪的总和，其升高时胆固醇酯转移蛋白活性增加，促进TG含量在HDL及LDL中表达增加，HDL和LDL中的TG会被肝脂酶和脂蛋白脂酶进一步水解形成小而致密的HDL和LDL颗粒，LDL颗粒则在血管壁沉积，促进动脉粥样硬化的发生[22]。研究结果显示，脑栓通胶囊小剂量组和大剂量组均可显著降低TG的水平。

综上所述，脑栓通胶囊可以显著降低总胆固醇、低密度脂蛋白及甘油三脂的水平，从而减少动脉粥样硬化的发生发展，提示该途径可能是脑栓通胶囊治疗脑卒中的作用机制之一。