无菌大鼠深二度烫伤感染金黄色葡萄球菌机体炎性反应的研究*

李鸿雁 颜克松 马东升 战大伟 孙兆增

(1.军事科学院军事医学研究院实验动物中心，北京 100071)(2. 中国人民解放军总医院第四医学中心，北京 100048)

近年来，随着烧伤休克防治理论和临床救治技术的提高,直接死于休克者已少见。感染已成为烧伤患者的主要致死原因,是烧伤防治研究的重要课题和难题之一[1]。金黄色葡萄球菌作为革兰阳性菌的代表是常见的皮肤条件致病菌，存在于临床伤口护理各个环节[2]，是引起人类化脓感染中最常见的病原菌，可直接导致局部化脓感染、肺炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。烧烫伤动物模型作为现代烧伤外科领域基础与应用研究中的一个极为重要的实验方法，常选用猪、狗、羊、兔、大鼠、小鼠和豚鼠[3]。烧伤创面脓毒症和创面用药的研究多用大鼠和小鼠[4]。随着近年来微生态研究的深入，采用无菌动物定植特定的病原菌，成为研究特定病原菌对机体的作用机制的重要方法[5-9]，本试验通过制备无菌大鼠烫伤模型并定向感染一定浓度的金黄色葡萄球菌和SPF级烫伤大鼠并定向感染金黄色葡萄球菌，观察4种模型动物伤口结痂时间、脱痂时间和愈合时间，分时项采样，测定血清炎性因子、检查伤口处皮肤病理损伤情况，探讨烫伤创面引发的损伤及金黄色葡萄球菌对烫伤愈合的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1试验动物： 6周龄SPF级Wistar雌性大鼠20只，由斯贝福实验动物科技有限公司提供(生产许可证号：SCXK(京)2016-0002)。饲养在符合GB14925—2010的屏障环境；6周龄无菌Wistar雌性大鼠20只，由解放军总医院第四医学中心动物实验室提供，饲养在隔离器内。

1.1.2主要试剂与仪器：金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]标准菌株购自南京一基生化科技有限公司；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1α(IL-1α)、表皮生长因子受体(EGFR)ELISA试剂盒及血平皿均购自北京欣仪生物科技有限公司。大鼠隔离器购自苏杭科技器材有限公司，恒温恒压烫伤仪购自山东省医学科学院；恒温培养箱购自上海微川精密仪器有限公司；酶标仪购自赛默飞世尔(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1金黄色葡萄球菌菌液制备：将标准金黄色葡萄球菌复苏后，采用标准划线法将细菌接种在血平皿中，倒置在37 ℃恒温培养箱中培养48 h，即可得到大量金黄色葡萄球菌菌落。用无菌接种环从培养皿中挑取2～3个菌落，放入装有少量无菌生理盐水的麦氏比浊管中，连续反复稀释混匀，直至比浊仪显示为1.0麦氏比浊度。此时，麦氏比浊管中金黄色葡萄球菌菌液的浓度为3×108CFU/mL，所得菌液用生理盐水1∶3稀释到1×108CFU/mL。

1.2.2染菌： 超净工作台用75%酒精擦拭后，紫外灯消毒30 min。将无菌大鼠从隔离器中用密闭消毒饲养盒取出，置于超净工作台内，按照50 mg/kg体质量腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，用刮胡刀片将大鼠背部刮至皮肤完全暴露。用恒温恒压烫伤仪94 ℃作用8 s，压力500 g在大鼠背部造成两个直径为2.5 cm的深二度烫伤伤口。随后大鼠随机分为两组，一组烫伤后直接传入大鼠隔离器内饲养观察，一组烫伤后伤口接种1×108CFU/mL金黄色葡萄球菌菌液后传入另一隔离器内单独饲养。SPF级大鼠采用相同方法烫伤后随机分为两组，一组烫伤后伤口接种1×108CFU/mL金黄色葡萄球菌菌液0.5 mL，一组不做处理，饲养在IVC内。

1.2.3测定指标与方法： 肉眼观察4组大鼠伤口结痂、脱痂及愈合时间并记录。在烫伤后24 h、48 h、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d时，眼眶取血，室温放置20 min，3 000 r/min离心10 min，收集上清，ELISA试剂盒检测TNF-α、IL-1α和EGFR水平；烫伤后24 h、3 d、7 d、10 d，每组选取1只大鼠取伤口处皮肤，4%甲醛溶液固定，用于病理制片，HE染色观察伤口处皮肤病理变化。

1.3 统计方法

2 结果

2.1 4组大鼠伤口结痂、脱痂和愈合时间

由表1可知，感染金黄色葡萄球菌的两组烫伤大鼠结痂时间显著长于未感染金黄色葡萄球菌的两组大鼠(P<0.05)；感染金黄色葡萄球菌SPF大鼠脱痂及愈合时间显著长于感染金黄色葡萄球菌无菌大鼠(P<0.05)。

表1 4组大鼠结痂、脱痂和愈合时间Table 1 The scab escharosis,decrustation and healing time of four groups of rats

2.2 烫伤大鼠伤口皮肤病理观察

图1-B、1-C分别为感染金黄色葡萄球菌SPF大鼠烫伤24 h时皮肤和皮下组织，皮肤细胞间质水肿，肌层呈化脓性炎细胞浸润；图1-D为感染金黄色葡萄球菌SPF大鼠烫伤7 d时皮肤及皮下组织，可见新生血管；图1-E为无菌大鼠烫伤72 h时皮肤及皮下组织，可见新生血管；图1-F为无菌大鼠烫伤10 d时皮肤及皮下组织，有肉芽组织生成；图1-G为感染金黄色葡萄球菌无菌大鼠烫伤72 h时皮肤及皮下组织，有大量新生小血管和新生肉芽组织形成。

图1 烫伤大鼠皮肤HE染色(×100)注：A：正常皮肤；B、C：感染金黄色葡萄球菌SPF大鼠皮肤烫伤24 h；D：感染金黄色葡萄球菌SPF大鼠皮肤烫伤7 d；E：无菌大鼠烫伤72 h；F：无菌大鼠烫伤10 d；G：感染金黄色葡萄球菌无菌大鼠烫伤72 hFig.1 The HE staining skin of burned ratsNote：A：Normal skin；B and C：The skin of SPF rat in Staphylococcus aureus infection group at 24 h after burned；D：The skin SPF rat in Staphylococcus aureus infection group at 72 h after burned；E：The skin of germ-free rat at 7 d after burned；F：The skin of germ-free rat group at10 d after burned；G：The skin of germ-free rat in Staphylococcus aureus infection group at 72 h after burned

2.3 炎性因子检测结果

由图2可知，4组大鼠烫伤后血清TNF-α水平均显著升高(P<0.05)，无菌大鼠及感染金黄色葡萄球菌无菌大鼠在烫伤24 h时，血清TNF-α水平显著高于SPF大鼠组和感染金黄色葡萄球菌SPF大鼠组(P<0.05)；烫伤72 h时，感染金黄色葡萄球菌SPF大鼠组显著高于其他3组(P<0.05)；烫伤7 d时，无菌大鼠和感染金黄色葡萄球菌无菌大鼠组显著低于两组SPF大鼠(P<0.05)。

图2 4组大鼠血清TNF-α水平Fig.2 The TNF-α level serum of rats in four groups(ng/L)

由图3可知，4组大鼠烫伤后血清IL-1α水平均显著升高(P<0.05)，无菌大鼠及感染金黄色葡萄球菌无菌大鼠在烫伤24 h时，血清IL-1α水平显著高于SPF大鼠组和感染金黄色葡萄球菌SPF大鼠组(P<0.05)；烫伤48 h时，无菌大鼠和感染金黄色葡萄球菌无菌大鼠组显著低于SPF大鼠组和感染金黄色葡萄球菌SPF大鼠组(P<0.05)，烫伤72 h时，感染金黄色葡萄球菌SPF大鼠显著高于其他3组。

图3 4组大鼠血清IL-1α水平Fig.3 The IL-1α level serum of rats in four groups(ng/L)

由图4可知，4组大鼠烫伤后血清EGFR水平均显著升高(P<0.05)，无菌大鼠及感染金黄色葡萄球菌无菌大鼠在烫伤24 h、48 h和72 h时血清EGFR水平显著高于SPF大鼠组和感染金黄色葡萄球菌SPF大鼠组(P<0.05)，感染金黄色葡萄球菌无菌大鼠显著高于无菌大鼠(P<0.05)。

图4 4组大鼠血清EGFR水平Fig.4 The EGFR level serum of rats in four groups(ng/L)

3 讨论

以往对烧伤并引发全身炎症反应综合征，甚至发展为多器官功能障碍综合征的动物模型的制备与研究，加深了我们对烧伤损伤机制的认识，但是存在一定的不足，不能分解分析烧伤后发生的两个过程：由烧伤创面引发的多种细胞因子及炎症递质的过度释放，从而引发的炎症反应；由肠道菌群移位引发的全身性感染。由于无菌动物肠道没有菌群的存活，制作的无菌动物烧伤模型，能够准确分析烧伤创面引发的损伤以及机体的反应。

由于烧烫伤使皮肤的防御功能遭到破坏，并且使创面产生丰富坏死组织和细胞，形成了天然的培养基，细菌更容易发生定植[10-11]。目前烫伤后感染模型的制备方法有2种：一种是动物烫伤后伤口擦刮标准菌株；另一种是烫伤后伤口皮下注射标准菌株[12-16]。沈娟等[17]研究表明深Ⅱ度创面擦刮法接种1×108CFU/mL金黄色葡萄球菌菌液可以制备感染创面防治研究的动物模型。所以本实验采用了浓度为1×108CFU/mL的金黄色葡萄球菌感染无菌大鼠及SPF级大鼠，均成功制备了大鼠烫伤感染模型。

金黄色葡萄球菌广泛存在，甚至健康个体也会携带。美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌，是人类化脓感染中最常见的病原菌之一。金黄色葡萄球菌擦刮法感染的SPF级烫伤大鼠，使其出现化脓性感染，伤口愈合缓慢。烧伤后机体处于应激状态，炎性因子大量释放[18]，其中IL-1α是单核细胞、内皮细胞、成纤维细胞等在应答感染时产生的细胞因子所产生，是一种参与免疫调节的促炎因子，是炎症反应中主要中间介质，可诱导内皮细胞活化，刺激中性粒细胞释放炎症蛋白和炎症介质，从而放大炎症反应[19]；TNF-α主要由单核吞噬细胞产生，是体内最重要的多功能促炎细胞因子[20]，通过增强中性粒细胞的功能，使释放的炎症介质增加，从而加重机体的损伤。实验中，4组大鼠烫伤24 h时，感染金黄色葡萄球菌无菌大鼠组血清IL-1α和TNF-α水平显著高于其他3组，与Balish等[21]的实验结果金黄色葡萄球菌在刺激无菌大鼠血清蛋白生成中起到显著作用相一致。EGFR广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用，在创面愈合过程中具有重要作用[22-23]。适度的细菌感染炎性刺激能够调动机体全身免疫机制，有利于吞噬细胞和生长因子大量产生，有利于伤口愈合[24]。烫伤24 h、48 h和72 h时，感染金黄色葡萄球菌无菌大鼠组血清EGFR水平显著高于其他3组，与感染金黄色葡萄球菌无菌大鼠愈合速度显著短于其他3组的结果相一致。Bauer等[25]和Levenson等[26]研究表明动物在出生后不久，其免疫系统被大量细菌刺激而激活，而无菌大鼠由于未受到菌群刺激，因而其细胞免疫和体液免疫不完善。

SPF大鼠烫伤后感染金黄色葡萄球菌，由于金黄色葡萄球菌产生的多种蛋白酶破坏细胞外基质和细胞间联系[27]，导致伤口化脓性感染，延缓了伤口愈合；无菌大鼠由于受到烫伤和金黄色葡萄菌分泌的超抗原的共同作用，调动处于休眠状态的全身免疫系统[28-29]，促进生长因子产生，从而缩短了伤口愈合时间。