Hartley豚鼠SPF级核心种群生长曲线与血液生理生化指标测定*

武卫国 范 涛 王 洪 王学文 刘佐民 柳全明

(中国食品药品检定研究院，北京 102629)

豚鼠原产于南美洲西北部，16世纪作为宠物由西班牙人带入欧洲。20世纪20年代后期，英国培育的短毛豚鼠Dunkin-Hartley是最早用于实验的品系。现今，豚鼠已经成为最常用的实验动物之一，在生命科学、生物医药、兽医学等领域有着不可替代的作用[1]。

Hartley豚鼠属封闭群品系，本单位所保持的Hartley豚鼠是1994年由日本引进，白化，清洁级(CL)，一直封闭繁育至今。近几年，通过剖腹产净化的方式对种群的微生物级别进行了提升，从清洁级上升至SPF级，并维持在屏障环境中饲养，构建了SPF级豚鼠核心种群，并逐步扩大生产。对于封闭群动物遗传质量控制，主要表现在保持其遗传组成具有较高的杂合性，使个体间存在较大的遗传性状差异，同时所有基因的相对频率保持稳定。而在剖腹产净化建立SPF种群时，用于剖腹产的豚鼠相对较少，改变了群体等位基因的频率，对群体的遗传特性造成重大改变。因此，重新建立一套清晰、明确的生物学背景数据作为各项实验研究中的参照具有其必要性。

本研究通过对Hartley豚鼠核心群生长体质量的监测，以及血液样本生理生化指标的测定，进一步完善该封闭群豚鼠的基础生物学数据与特性，为该群体遗传质量的维持以及日后的广泛应用奠定基础。

1 材料与方法

1．1 实验材料

1.1.1主要设备和耗材:电子秤(上海良平仪器仪表有限公司B10002，中国)；全自动血细胞分析仪(NIHON KOHDEN CelltacE MEK-7222，日本)；全自动生化分析仪(Olympus AU400，日本)；离心机(Eppendorf X22，德国)；0～100 μL微量移液器(Eppendorf，德国)；1.5 mL离心管(Axygen，美国)；1.5 mL EDTA-K2雾化抗凝管(国产)；2 mL无菌注射器(上海米沙瓦医科工业有限公司，中国)；血液生理生化检测相关试剂由本单位实验室提供。

1.1.2实验动物:取Hartley豚鼠SPF级核心群中健康个体，50只，体质量250～300 g，雌、雄各半，每个繁殖单元至少选择1雄1雌，由中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所提供，许可证号：SCXK(京)2017-0013。豚鼠核心群饲养在屏障环境中，开放笼盒，环境参数：温度22～26 ℃，相对湿度40%～70%，洁净度7级，明暗交替12/12 h。饲养期间饲喂市售60Co辐照灭菌全价生长繁殖饲料(北京科奥协力饲料有限公司)，高压灭菌水(pH 7)。

1．2 实验方法

1.2.1豚鼠称质量:电子秤使用前调至水平并用砝码进行校准。豚鼠出生当日记为第0 d，剪耳标号，逐日进行称质量并记录，7 d后离乳，雌、雄分笼饲养(<350 g时10只/笼，≥350 g时5只/笼，笼盒尺寸：78 cm×48 cm×24 cm)，自由采食全价饲料及饮水，体质量记录至8周龄。

1.2.2豚鼠采血:250～300 g豚鼠通过心脏穿刺法采集血液，采血前禁食12 h，不禁水。一人抓取豚鼠保定，暴露胸口，另一人用2 mL注射器，触摸胸口心搏最强处进针，缓慢抽取，采集1.5～2 mL血液。约1 mL血液注入雾化EDTA-2 K抗凝管中，充分颠倒混匀，用于血液生理指标的测定；其余注入普通离心管，室温20～25℃静置2～3 h析出血清，3 000 r/min，离心10 min，吸取上清至新管，-20℃冻存，用于血液生化指标的测定。

1.2.3血液生理生化指标测定:用全自动血细胞分析仪对抗凝血液样本进行逐一检测，项目包括：白细胞计数(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞积压(HCT)红细胞体积(MCV)、血红蛋白含量(MCH)、血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞分布宽度(RDW)、血小板计数(PLT)、血小板压积(PCT)、血小板容积(MPV)、血小板分布宽度(PDW)、淋巴细胞计数(LYM)、单核细胞计数(MON)、中性粒细胞计数(NEUT)、嗜酸性粒细胞计数(EOS)、嗜碱性粒细胞计数(BAS)等；将各血清样本室温解冻，取300 μL置于生化管内，放入全自动血液生化分析仪中进行检测，项目包括：丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、碱性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、葡萄糖(GLU)、钙(CA)、磷(P)、胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、总胆红素(TBIL)等。

1．3 统计方法

2 结果

2．1 生长曲线测定结果

豚鼠0～8 周龄体质量称量结果见表1。根据体质量变化数据，分别绘制雌、雄生长曲线，见图1。

表1 Hartley豚鼠0～8周龄体质量(g)Table 1 Body weight of Hartley guinea pigs between 0～8 weeks of age(g)

图1 Hartley豚鼠0～8周龄生长曲线Fig.1 Growth curves of Hartley guinea pigs between 0～8 weeks of age

2．2 Hartley豚鼠血液生理测定结果

应用全自动血细胞分析仪检测出血液生理指标见表2。Hartley豚鼠血常规指标中，白细胞计数(WBC)、中性粒细胞计数(NEUT)、嗜酸性粒细胞计数(EOS)3项指标，在雌性与雄性间有显著性差异(P<0.05)。血小板压积(PCT)、血小板容积(MPV)、淋巴细胞计数(LYM)、淋巴细胞百分比(LYM%)、中性粒细胞百分比(NEUT%)、嗜酸性粒细胞百分比(EOS%)、嗜碱性粒细胞百分比(BAS%)在雌、雄性别间表现为差异极显著(P<0.01)，其他指标差异不显著(P>0.05)。

表2 Hartley豚鼠血液生理指标Table 2 Blood physiological indexes of Hartley guinea pigs

2．3 Hartley豚鼠血液生化测定结果

应用全自动血液生化分析仪检测13项生化指标，见表3。生化常规指标中，碱性磷酸酶(ALP)两性别间有显著性差异(P<0.05)，雄性显著高于雌性。尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、胆固醇(CHO)3项指标，两性别间差异极显著(P<0.01)，其中尿素氮、肌酐雄性极显著高于雌性，而胆固醇水平雄性极显著低于雌性。其他指标差异不显著(P>0.05)。

表3 Hartley豚鼠血液生化指标Table 3 Blood biochemical indexes of Hartley guinea pigs

2．4 SPF级与清洁级豚鼠各参数比较结果

根据2009年本单位所测得的清洁级Hartley豚鼠血液生理生化指标[2]进行对比，结果见表4。通过11项血液生理指标对比发现，在雄性SPF级与CL级豚鼠中除白细胞计数(WBC)差异不显著(P>0.05)外，其他指标均存在极显著差异(P<0.01)；而雌性豚鼠中，红细胞体积(MCV)与血小板计数(PLT)两项指标无显著差异(P>0.05)，其他指标均存在极显著的差异(P<0.01)。差异显著的指标中，红细胞计数(RBC)、红细胞分布宽度(RDW)、淋巴细胞百分比(LYM%)、血小板容积(MPV)等指标SPF级豚鼠显著低于清洁级。

表4 SPF级与清洁级Hartley豚鼠血液生理生化指标比较Table 4 Comparison of hematological parameters between SPF and CL Hartley guinea pigs

在对9项血液生化指标比较中，除两种级别雄性豚鼠血钙含量差异显著(P<0.05)外，其他指标在SPF级与清洁级豚鼠间存在极显著差异(P<0.01)。差异极显著的指标中，丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、葡萄糖(GLU)等，SPF级豚鼠都显著低于清洁级，其他指标高于清洁级。

3 讨论

血液生理生化指标在临床、实验中有着重要意义，是实验动物应用中的重要基础生物学数据[3-7]。本实验测定了Hartley豚鼠SPF级核心种群的生长曲线以及血液生理生化指标，为该群的日后应用提供了基础数据参考。该种群在作者所在单位已饲养传代多年，并且通过剖腹产净化将种群的微生物等级上升至SPF级，其血液生理生化指标已发生了重大改变，通过与2009年的数据对比，11项血液生理指标、9项血生化指标都表现出极显著差异。动物所处的环境，饲料、饮水种类以及饲养密度方式等均对血液生理生化值产生着影响。SPF级豚鼠饲养在屏障环境中，温度维持在20～26 ℃、相对湿度40%～70%，空气洁净度控制在万级(7级)，所用笼具、饲料、饮水等物品均经过高压或辐照灭菌处理，同时，饲养人员在接触动物前均要进行淋浴，更换灭菌服，因此，SPF级豚鼠接触到外界抗原的几率较普通级与清洁级动物大幅降低，致使其参与免疫反应的淋巴细胞显著减少，在血液生理指标中SPF级豚鼠淋巴细胞数量与淋巴细胞百分比极显著低于清洁级，这与张琨等[4]、邝少松等[5]、张晓玉等[6]相关研究报道的结果相一致。

环境微生物的差异同时会导致肠道微生物菌群的改变，使得豚鼠对蛋白、糖类、脂肪等营养物质的代谢发生变化[8-9]，进而影响血液生化中部分指标在SPF级与清洁级豚鼠间存在显著差异，比如碱性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)等。豚鼠属草食性动物，对粗纤维消化能力强，同时，体内缺乏左旋葡萄糖内酯氧化酶而不能合成维生素C[10]。在GB 14924.5—2001中[11]，豚鼠生长繁殖与维持饲料中的粗纤维含量都要求在10%～15%，维持饲料中Vc含量≥1 500 mg/kg(繁殖料≥1 800 mg/kg)。保持全价饲料中粗纤维比例与Vc含量是饲养管理中关注的重点，同时也是维持SPF级豚鼠正常血液生理生化指标的重要因素。

在相同环境下，SPF级豚鼠血液参数在性别之间也存在着差异，如血小板压积(PCT)、血小板容积(MPV)两项指标，雌性豚鼠都极显著低于雄性豚鼠；生化指标中，碱性磷酸酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、胆固醇(CHO)在两性别间也表现出显著与极显著差异，由此说明，实验豚鼠的微生物级别、饲养环境、性别、周龄等都是其生理指标的影响因素，可能会对实验结果产生不同影响，在日后的应用中应有所选择。

本豚鼠群是通过对清洁级豚鼠进行剖腹产净化扩繁而来，剖腹产建群是由少数孕鼠中获得后代，再经过几代形成一定规模，由于“奠基者”效应的影响，使得新群体的遗传结构发生变化，产生遗传性状的漂移[12]。封闭群实验动物繁育原则是尽量避免近交，同时维持该群体的遗传稳定性，然而在现有的繁育体系下，即使保持着足够数量的群体有效含量以及较低近交上升速率，也无法阻止遗传漂变的产生。因此，遗传性状的定期监测更显示出其必要性。群体各项生物学数据的正常值不仅仅是从当前群体获得，而是需要多年的数据积累，重新测定的基础生物学数据有很多属于遗传力高的性状，通过检测，不仅了解了当前群体的特性，同时有助于新建立群体的遗传学质量评价，为“二次优选法”纠正遗传漂变提供数据支持。