流感病毒感染对肺肠功能的损伤及中药干预作用

王惠娴 叶毅 徐培平 刘金元 赵昉

流行性感冒（influenza）简称流感，是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，具有高度的传染性，常引起暴发流行［1］。临床上，部分患者发病表现为胃肠型感冒，以恶心、呕吐、腹痛、腹泻等胃肠道症状为特征［2，3］。有研究表明，A型流感病毒（H1N1）感染会引起小肠免疫损伤［4］。张淑静、吴莹等研究发现流感病毒H1N1感染小鼠后，存在特异性肠道病变，病变累及小肠及大肠组织［5］，说明流感病毒感染能扩散感染到肺脏之外的组织和器官，但该结论仍存在很大的争议。如在H1N1／2009流感病毒感染小鼠模型中，脾脏、胸腺、大脑和肠道组织中都没有检测到流感病毒的存在［6］，而在小肠中检测到了禽流感病毒H5N1和H7N2病毒，人类的H1N1病毒则没有检测到［7］。此外，对流感病毒是否可以在肺脏以外的组织中复制和增殖，也存在一定的争议。有研究表明H1N1病毒不能直接感染人体肠道组织并在人体肠道组织中复制［4］，而禽流感A（H5N1）病毒可直接感染人体肠道组织并在人体肠道组织中复制［8］。目前，流感病毒感染引起肠道功能损伤的原因及机制尚不十分清楚。

中医认为流感属于外感温热病范畴，病位以肺为主，可及胃肠。病因是外感温热病邪，初起时病位以肺卫为中心，随病程的发展，肺卫之邪内传入里，即可顺传气分，直犯肺卫及胃肠［9］。但中药对流感的肺肠病变是否具有确切的治疗作用仍不清楚。因此，本研究拟建立小鼠甲型流感病毒性肺炎模型，检查呼吸道流感病毒感染过程中是否存在肺肠道功能损伤，并探讨加减银翘散的干预作用。

材料与方法

一、材料

1.动物与毒株

BALB／c小鼠，雄性，13～15 g，由广东省医学实验动物中心提供，SPF级。流感病毒A／FM／1／47（H1N1）鼠肺适应株，由中国医学科学院医药生物技术研究所提供，广州中医药大学热带医学研究所病毒室冷冻保存。

2.药物与试剂

乙醚购自广州化学试剂厂（批号20180901）。ELISA酶联试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。加减银翘散：系由银翘散进行化裁而来，主要由银花、连翘、野菊花、藿香、苍术等药物构成。方中以银花、连翘、野菊花清热解毒为君，以藿香、苍术、茯苓、杏仁宣肺化湿为臣，生地、丹皮清热凉血为佐，甘草调和诸药为使。

上述方药按剂量比例配置，根据《中药药理研究方法学》［10］，按体表面积换算动物给药剂量。

二、实验方法

1.分组与造模

小鼠分正常对照组，病毒对照组及加减银翘散组，每组各12只。在乙醚轻度麻醉下，小鼠滴鼻感染10 LD50流感病毒液。感染后2 h开始给药，继续给药4 d。每天称体重，记录观察毛发、活动度、大小便情况。加减银翘散剂量为50 g／kg（生药材），给药容积20 mL／kg。病毒对照组给予生理盐水，每日1次。感染后5 d，杀剖小鼠，称体重和肺重。同时收集支气管肺泡灌洗液、肠道冲洗液及肺、十二指肠、回肠、空肠、结肠、直肠进行相应检查。

2.甲型流感病毒唾液酸酶（HA）抗原检测

采用ELISA检测肺及十二指肠、回肠、空肠、结肠、直肠等的流感病毒HA抗原含量。

3.sIgA检测

按试剂盒说明书方法采用ELISA法检测支气管肺泡灌洗液及肠道冲洗液sIgA水平。

4.HE染色进行组织病理学分析

各组小鼠于感染后5 d处死动物，小心快速摘取肺及十二指肠、回肠、空肠、结肠、直肠等组织于10%的福尔马林中固定，按HE病理常规进行。

5.细胞因子检测

各组小鼠于感染后5 d取材，快速摘取肺及十二指肠、回肠、空肠、结肠、直肠等组织，加生理盐水按1∶9比例进行组织研磨，3 000 r／min离心10min，收集组织上清，以ELISA法检测细胞因子（TNF-α，IFN-γ，IL-6，IL-17）水平。

“如果没有猜错，两位就是子虚先生与乌有先生吧！纯阳子虚，翠玉白衣，烛花掌天下无对；皇家乌有，李弘之师，一身点穴功夫深不可测，我在长安都听说过的！”袁安说。

6.肺肠粘膜免疫功能检测

收集肺及大小肠组织上清，ELISA法检测Toll受体（Toll 3、4、9）及整合素（αvβ3、α4）分子水平。

三、统计学分析

采用SPSS 18.0进行数据统计，肺指数水平值、ELISA实验值采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、小鼠流感病毒感染后肺脏炎症变化

病毒对照组小鼠大多在感染流感病毒3 d以后发病，出现耸毛，卷缩，毛无光泽，活动减少，食量减少，体重减轻，呼吸加快、短促，大便稀溏。正常组小鼠肺组织结构正常，未见炎症性病变。病毒对照组肺组织出现不同程度的炎性病变，肺泡壁大量炎性细胞浸润，肺泡壁增宽，结构不清，出现水肿，而加减银翘散组较之较轻，与肺指数结果相一致（图1）。

二、小鼠流感病毒感染后肠道病理变化

HE染色结果显示，流感病毒感染小鼠大小肠均见炎症病变，尤以回肠与结肠段最为严重。与正常组相比，病毒组小鼠十二指肠、空肠、回肠、结肠、直肠均有不同程度的炎性病变，尤以空肠、回肠、结肠组织部位的炎性病变较重。十二指肠局部粘膜上皮细胞坏死脱落，肠绒毛结构破坏，粘膜层可见明显的炎性细胞浸润，固有层中腺体未见明显的萎缩，周围可见炎性细胞浸润，粘膜下层有些水肿。空肠局部粘膜上皮细胞坏死明显，固有层中腺体消失，被新生的结缔组织取代，可见明显的炎性细胞浸润，粘膜下层结构疏松水肿明显。回肠粘膜上皮细胞发生明显的坏死脱落，粘膜局部缺损，固有层中腺体消失，被结缔组织取代，粘膜下层可见炎性细胞浸润。结肠粘膜上皮细胞有些坏死脱落，局部粘膜上皮层缺损，固有层腺体消失，缺失的粘膜上皮细胞被新生的结缔组织取代，新生组织中可见炎性细胞浸润。直肠粘膜上皮细胞局部绒毛上皮细胞坏死脱落，粘膜结构破坏，粘膜层可见炎性细胞浸润，固有层腺体结构也发生破坏，粘膜下层结构疏松有些水肿。加减银翘散组炎性病变较病毒对照组炎性病变较轻，以回肠和结肠发病较为明显（图2）。

图1 小鼠流感病毒感染后各组肺脏病理变化

三、小鼠流感病毒感染后肺肠组织病毒HA抗原水平变化

小鼠感染流感病毒5 d后，病毒对照组肺、十二指肠、空肠、回肠、结肠、直肠均见有病毒HA抗原，其含量与正常对照组相比有明显升高，差异有统计学意义。与病毒对照组相比，加减银翘散组肺肠HA抗原水平明显降低（图3）。

图2 小鼠感染流感病毒后肠道病理组织变化（HE，×100）

图3 小鼠流感病毒滴鼻感染后病毒HA抗原水平变化

四、小鼠感染后肺肠组织sIgA水平变化

图4 小鼠流感病毒滴鼻感染后肺肠组织sIgA水平变化

五、小鼠流感病毒感染后肺肠组织细胞因子水平变化

小鼠感染流感病毒第5 d，病毒对照组肺及十二指肠及空肠、回肠、直肠细胞因子TNF-α、IL-6、IL-17水平明显升高，结肠TNF-α和IL-6水平明显升高，与正常对照组小鼠相比，差异有统计学意义，加减银翘散能明显降低上述组织细胞因子水平。IFN-γ水平在肺肠组织中未见明显升高，与正常对照组小鼠相比差别无统计学意义（图5）。

图5 小鼠感染流感病毒后肺肠组织细胞因子水平变化

六、小鼠流感病毒感染后肺肠组织粘膜免疫功能的变化

小鼠感染流感病毒第5 d，病毒对照组肺及十二指肠 及 空 肠、回 肠、结肠、直肠组织中Toll受体（TLR3、TLR4、TLR9）、整合素（αvβ3、α4）分子水平明显升高，与正常对照组小鼠相比，差别有统计学意义，加减银翘散能明显降低上述组织中的Toll受体及整合素分子水平（图6）。

讨 论

流感患者常见有腹泻、恶心等呼吸道外临床表现。本研究中，我们发现流感病毒除了引起肺部的炎症病变外，在小肠（十二指肠、空肠、回肠）、大肠（结肠、直肠）部位均出现了炎症性病变，以回肠及结肠段炎症病变最为严重。流感病毒感染小鼠同时伴有食欲不振，消瘦、厌食、大便稀溏等胃肠道临床表现。从中医角度来讲，“肺与大肠相表里”，肺与大肠不仅在生理上相互联系，而且在病理上相互影响，出现肺病及肠或肠病及肺，肺肠之病可以相互传变，甚至持续形成恶性循环［11］。流感属于中医外感热病范畴，“外感重肺肠”是中医药治疗的重要方法。肺主皮毛而统表，大肠主传导化物而治理；肺为娇脏，太阳主表，为一身之藩篱，是人体与外界的第一道屏障，最易受外界六淫之邪侵袭。肺受邪后，宣肃之职失常，从而出现发热、恶寒、咳喘、喷嚏、流涕等症状；因肺与大肠相合，邪气通过表里相传，则易传至大肠，出现肺热移肠的便秘、泄泻、大便稀溏等症状。故外感病症的发病可由肺病及肠，或肺肠同病［12］。流感发病初期表现为肺胃蕴邪，湿毒壅滞，肺失宣肃，而见发热、流涕、鼻塞、咳嗽、咽痛；如果侵犯胃肠，则胃肠失和，气机失降，则出现恶心、呕吐、腹痛、腹泻、稀水样便；进一步的发展则毒邪内陷，肺气郁闭，损伤肺络，则见高热、喘憋、呼吸急促，便秘等病毒性肺炎等症状。银翘散系临床治疗流感类外感的常见基础方药［13，14］，我们根据流感的发病机制及中医“外感重肺肠”的理论，在临床与实验室研究的基础上，在银翘散基础上增加了清热凉血、宣肺化湿解毒中药，组成治疗流感的中药复方加减银翘散［15～17］。方中的银花、连翘、野菊花清热解毒为君，以藿香、苍术、获苓、杏仁宣肺化湿为臣，生地、丹皮、清热凉血为佐，甘草调和清药为便。实验证明加减银翘散能抑制流感病毒感染小鼠肺肠炎性病变，改善肺肠粘膜免疫功能。

对于流感病毒感染导致的肠道损伤的机制，Wang等研究未在小肠中检测到流感病毒抗原，认为流感病毒感染小肠炎症是肠道菌群构成的变化（菌群失调）介导了呼吸道流感病毒感染诱导的特异性肠道免疫损伤［4］。而我们在小肠和大肠中均检测到甲型流感病毒HA抗原水平明显升高，说明流感病毒可以直接感染肠道组织。本研究检测了肺肠部位相关炎症因子水平，肺肠组织中TNF-α，IL-6，IL-17等水平明显升高，说明流感病毒感染引发了肺肠炎症反应。本研究发现肺肠组织中IFN-γ水平没有明显升高，与Wang等的研究不一致［4］。

图6 小鼠流感病毒感染后肺肠组织粘膜免疫功能的变化

流感病毒经呼吸道粘膜感染侵袭，常可导致流感病毒性肺炎。而肠道和支气管肺部相关淋巴组织同属于粘膜免疫系统的重要构成部分。分泌型IgA（sIgA）是粘膜免疫系统抵御外来病原体侵袭的主要免疫分子。流感病毒感染常导致机体免疫抑制，并可继发感染细菌，时常伴发胃肠道炎症［18］。本研究表明流感病毒可抑制支气管肺泡灌洗液及肠道冲洗液中sIgA的分泌，而加减银翘散可提升肺肠粘膜sIgA的分泌水平。Toll样受体家族是一种重要的模式识别受体，可通过识别病原体而启动胞内信号转导，参与炎症反应和免疫调节。在肺脏和肠道组织中，许多的病原体能直接粘附或感染粘膜上皮细胞。故在流感病毒感染时，被感染的巨噬细胞能够释放大量的干扰素，呼吸道上皮细胞继而会在干扰素的作用下上调其表面TLR的表达，上调的TLR对病原体的直接识别将导致炎症介质从巨大的呼吸道表面释放出来而导致炎症的爆发［19］。其中TNF-α是一种可由多种细胞产生的具有广泛生物学活性的前炎症细胞因子，它能诱导血管内皮细胞表达粘附分子，促进炎症细胞的浸润与活化，并可刺激血小板活化因子、前列腺素、白三烯等炎症介质合成［20］。本研究中，流感病毒感染小鼠，肺肠组织中Toll 3，4，9受体水平显著增加，连同IL-6，IL-17，TNF-α炎症因子水平增加，对肺肠病理炎症带来或加重损害。加减银翘散治疗可以降低肺肠组织Toll受体及炎症因子水平，减轻炎症损害。

肺与大肠之间也存在着粘膜淋巴细胞归巢迁移的免疫相关性。粘膜淋巴细胞归巢作为粘膜免疫重要活动之一，具有定向选择性。粘膜淋巴细胞的这种选择性与它表面的相关受体和粘膜部位血管内皮细胞上表达的血管定居素特异性识别有关，如在粘膜特异性受体整合素α4β7等［21］。本研究发现流感病毒感染小鼠肺肠组织中整合素分子αvβ3，α4水平升高，相关的支气管肺泡灌洗液及肠道冲洗液中TNF-α含量也增加，通过肺肠相关整合素和TNF-α受体结合，通过免疫细胞的定向归巢迁移发挥炎症相关效应损伤。

总之，流感病毒感染能导致呼吸道和肠粘膜组织免疫损伤，而加减银翘散治疗能改善流感病毒感染小鼠肺肠功能损伤及炎症病变。由于呼吸道和肠道系统属于粘膜免疫系统的一部分，流感病毒感染不仅可通过相应的感染细胞侵袭到肠粘膜，从而对肠道造成损害，同时也可以通过共同粘膜免疫系统造成肺肠损伤。肠粘膜免疫作为肺-肠轴的中心，共同影响肺和肠。此外，流感病毒感染可造成肠道菌群紊乱，肠道菌群失调常与肠道炎症的发生有关。流感病毒PR8感染小鼠后，分段的丝状菌和乳酸杆菌／乳球菌数量减少，肠杆菌科数量增加，流感感染通过改变肠道微生物群的组成而引起肠道损伤［22］。但呼吸道流感病毒感染引起肠道免疫损伤的具体机制仍不清楚，尚需进一步研究。