核酸适配体在病原生物学中的应用研究进展

贺宏斌

核酸适配体（Aptamer，亦名核酸适体或适配子）是利用核苷酸之间严格的识别能力和亲和力而设计的人工合成寡核苷酸，并通过指数富集配体的系统进化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技术筛选获得［1，2］。核酸适配体的靶标类型非常广泛，包括离子、小分子、多肽、蛋白质，乃至是整个活细胞、细菌、病毒和寄生虫等。除了对靶标物具有高特异性和高亲和力外，核酸适配体还具有合成简单、相对分子质量低、化学稳定性高、毒性低、免疫原性低、价格低廉、程序可控和便于体外修饰上多种功能基团或材料等优点。核酸适配体作为一种新型的识别分子，目前已发展成为一种备受关注的新型检测和治疗工具，在生物医学领域发挥了重要作用，已广泛应用于病原检测、药物研发、疾病诊断和治疗等方面，并且显示出巨大的应用潜力和广阔的应用前景。本文简要介绍核酸适配体在病原生物学中的研究应用。

一、核酸适配体的筛选

从随机单链寡核苷酸文库中进行筛选，得到特异性很强的核酸适配体，主要依赖于SELEX这种体外筛选技术。1990年Ellington和Szostak［3］首次运用该技术成功地从随机RNA文库中筛选出能与有机染料特异性和亲和性结合的随机寡核苷酸，并命名为“aptamer”。核酸适配体的筛选过程主要包括以下步骤：一是将体外化学合成的随机单链寡核苷酸文库与靶标混合、孵育，结合形成靶标-核酸适配体复合物；二是运用离心、滤膜过滤、电泳等方法将未与靶标结合的核酸分离、去除，以获得与靶标稳定结合的核酸适配体；三是以此能与靶标稳定结合的核酸分子序列为模板进行PCR扩增生成次级寡核苷酸文库，再进行下一轮的筛选。经过反复多轮的筛选，淘汰未与靶标结合或结合弱的DNA或RNA分子，随着寡核苷酸库中对靶标物高亲和性的不断富集，最后从随机文库获得能与靶标物分子特异性结合具有高亲和性的寡核苷酸链，即靶标的核酸适配体。

传统的SELEX方法操作繁琐，筛选周期长，有时需要几个月才能筛选出与靶标具有特异性结合高亲和性的核酸适配体。随着SELEX等技术的快速发展，很多新型的筛选方法不断涌现［5，6］，如在提高核酸适配体亲和力的筛选方法、提高核酸适配体普适性的复合靶筛选方法、增加核酸适配体稳定性筛选方法、缩短筛选周期的筛选方法、提高目标核酸适配体筛选机率的筛选方法以及增大核酸适配体应用范围的更优化的新型核酸适配体筛选方法做了大量工作。根据不同靶标物的具体情况以及研究目的等选择和发展合适的筛选方法，这些新的筛选技术和方法大大提高了筛选周期和筛选效率，增加其稳定性和亲和力，拓展了核酸适配体的应用范围，促进了核酸适配体在各个领域中的研究应用前景［7］。

二、核酸适配体在细菌方面的应用

细菌致病菌的检测，传统方法主要包括形态检查和生化方法，准确性和灵敏性较高，但涉及的实验较多，需要进行细菌分离、培养及一系列生化反应，操作繁琐、需要时间较长且成本高。利用适配体人工模拟抗体的特性可用于检测致病菌，近年已开展适配体用于结核分枝杆菌和伤寒杆菌检测的研究探索，马占忠和蔡江丽等分别以结核杆菌分泌蛋白ESAT-6和分泌蛋白64编码基因作为靶标，通过SELEX技术筛选获得ESAT-6和分泌蛋白64抗体的核酸适配体，为研究开发结核病的诊断和治疗试剂提供了平台和基础。基于SELEX技术筛选的结核杆菌分泌蛋白64抗体适配体，进一步建立了混合夹心ELISA检测体系，应用于230例临床血清标本的检测，结果表明适配体混合夹心ELISA法用于结核病的血清学检测具有一定的诊断价值［8］。潘勤等以IVB型纤毛结构蛋白prepilS为靶标，通过体外构建一个含有30个随机序列的单链DNA（ssDNA）文库，PCR扩增为双链DNA随机文库后，体外转录构建RNA随机文库，经8轮筛选获得具有特异性高亲和力prepilS蛋白的RNA适配体，该RNA适配体可显著抑制伤寒杆菌侵入THP-1细胞，为开发预防、治疗伤寒杆菌肠热症的新型药物提供了基础。

基于核酸适配体的可视化检测方法具有灵敏度高、特异性强、分析时间短等优点，核酸适配体的可视化检测方法研究一直是近年的研究热点。利用纳米金在高盐浓度下发生团聚溶液颜色由红色变为紫色，而核酸适配体吸附在纳米金表面时，在高盐条件下可保护纳米金防止其发生团聚，溶液颜色则不发生变化仍为红色，这样通过观察颜色变化就可直接快速判断结果，Wu WH等［9］开发的纳米金-适配体生物传感器检测方法检测大肠杆菌O157∶H7和鼠伤寒沙门氏菌，可在20 min或更短的时间内检测低至105菌落形成单位（cfu）／mL的靶标菌，且特异性达100%，这种简便不需要专门仪器的方法可望今后用于快速检测细菌。基于纳米金结合放大信号技术的适配体传感器具有更高的灵敏度，能检测到更低浓度的致病菌。2015年Wu SJ等［10］基于磁性纳米金与特定的适配体结合开发了一种简单的比色传感器系统用于检测副溶血性弧菌，表面包覆着大量HRP的纳米金与适配体连接作为信号放大器，用此方法检测靶标菌副溶血性弧菌的范围为10～106cfu／mL，检测限可达10 cfu／mL。Yuan等［11］利用生物素与亲和素结合技术将适配体固定在微孔板上作为捕获探针，用适配体识别结合纳米金发展了一种比色传感器方法检测金黄色葡萄球菌，其检测范围为10～106cfu／mL，检测限达9 cfu／mL；基于适配体识别结合酪胺信号放大技术Yuan等进一步开发了一种金黄色葡萄球菌视觉检测方法，检测金黄色葡萄球菌范围为10～107cfu／mL，检测限可达8 cfu／mL。Yuan等［12］利用核酸适配体识别技术，结合纳米金标记和银信号放大技术，建立了一种灵敏检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，可对样品中的鼠伤寒沙门氏菌进行快速检测，其检测范围为10～106cfu／mL，检测限则可达7 cfu／mL，这些基于核酸适配体的高敏感性和特异性的可视化检测技术为现场快速检测病原菌提供了新的方法。

利用抑制性适配体可直接结合于病原体靶物质的表位，理论上可以阻断病原体与生物机体的结合从而使疾病得到控制。在抑制性适配体方面也有初步的探索报道，杨清武等在成功构建含40个随机序列的单链DNA（ssDNA）文库的基础上，采用液相筛选方法经过4轮筛选，以内毒素（LPS）蛋白为靶标，建立了从随机单链DNA文库筛选LPS寡核苷酸适配体的SELEX技术，为进一步开展抑制性适配体用于临床脓毒症的防治研究提供了平台和参考［13］。

三、核酸适配体在病毒方面的应用

随着SELEX新技术的发展，已筛选出针对逆转录酶、解螺旋酶和病毒衣壳蛋白等各类型病毒靶分子的适配体。这些可特异性的识别病毒的适配体可用于疾病诊断，而能识别并且能结合到病毒的特定部位上直接影响病毒的复制或抑制病毒的适配体可望用于疾病的防治和治疗。Li等［14］以感染新加坡石斑鱼虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus，SGIV）的细胞为靶标，筛选出高特异性和亲和力的适配体Q3，并以此适配体替代抗体发展了一种适配体-ELASA检测方法，该检测方法灵敏度高，可检测到低至2×104病毒感染的细胞数，并且当与病毒感染细胞结合的时间短至1 min时仍可检测到。Zhou等［15］利用特异性结合的适配体A10，开发了快速诊断赤点石斑鱼神经坏死症病毒（Red spotted grouper nervous necrosis virus，RGNNV）的适配体sandwich ELASA方法，检测病毒感染的细胞数可低至4×103。这些基于适配体的ELASA法不仅其检测结果与PCR方法基本一致，而且适配体-ELASA法还具有操作简便快捷、稳定性强的优点。Gopinath等［16］设计了以全病毒作为靶标筛选核酸适配体的策略，筛选获得针对A型流感病毒H3N2株血凝素HA区域的RNA适配体，可通过结合到靶毒株的HA蛋白上以有效地抑制HA介导的膜融合，从而抑制流感病毒的感染，其与HA的亲和性比单克隆抗体约高15倍，可用于鉴定A型流感病毒的不同亚型。Jeon等报道以血凝素蛋白HA为靶标，筛选了作用于HA受体结合区域的DNA适配体，体内试验结果表明适配体不仅抑制病毒的凝血能力，还可防止病毒结合和进入细胞，从而抑制病毒与宿主细胞的结合阻断流感病毒感染细胞。

核酸适配体在肝炎和艾滋病等严重影响人民身体健康的重大传染病方面也有研究报道。Butz等［17］报道利用多肽适配体筛选系统以HBV核心抗原蛋白为靶标筛选出了8个核酸适配体，其中适配体C1-1能有效抑制HBV病毒衣壳的形成，从而影响病毒的复制和病毒的生产，为开发具有特异性抗病毒作用的乙肝治疗提供了新的基础。基于针对HBV表面抗原的核酸适配体结合磁性分离和免疫化学发光技术报道也可用于HBsAg的检测，其检测灵敏度可达0.1 ng／mL。Tomai等以RNA聚合酶为靶标筛选出针对HCV3a亚型的适配体，可抑制RNA聚合酶的活性，从而干扰HCV病毒的复制。Kikuchi等［18］报道筛选获得分别可特异性结合HCV的内核糖体位点（the internal ribosome entry site，IRES）区域Ⅱ和区域Ⅲ的适配体，可以抑制IRES依赖的转录，通过影响病毒mRNA的转录从而影响HCV病毒的复制，并且结合区域Ⅱ位点的核酸适配体的抑制效率比结合区域Ⅲ的要大约10倍。NS3为一种对HCV的复制和病毒扩增非常重要的多功能酶，Fukuda等筛选出了针对HCV NS3的适配体，在细胞水平上该核酸适配体显示能抑制病毒的繁殖，这些能直接影响病毒的生成、病毒的转录复制或抑制病毒繁殖的核酸适配体可望为肝炎的治疗提供了新的途径。Yamamoto等［19］报道筛选获得了能与HIV-1 Tat蛋白特异性结合的RNA适配体（RNATat），在细胞水平上可以使HIV-1的复制减少，可以明显抑制HIV的活性，表明利用针对反转录激活因子蛋白的适配体，在病毒反转录的早期从细胞水平上可干扰HIV的复制和表达，并且毒性小，较少形成耐药株，为艾滋病的治疗提供了一种新的途径。

四、核酸适配体在寄生虫等方面应用

寄生虫病仍然是严重威胁着人类生命健康的疾病，特别是在欠发达国家和地区迫切需要研究探索新的诊疗方法和发展药物的新策略。近年来研究报道筛选到分别可特异识别血吸虫虫卵［20］、锥虫（T.cruzi）［21-23］、白蛉中的利什曼原虫［24］、血液中的疟原虫［25，26］以及疟原虫感染的红细胞［27］等各种适配体，为开发新型人体寄生虫检测及控制方法提供了新的途径。

为获得可特异识别血吸虫虫卵的核酸适配体，Long等［20］建立了一个含有1013～1016个单链DNA随机文库，在第一轮和第二轮筛选中用日本血吸虫虫卵作为阳性对照，以最大可能富集单链DNA序列，然后再用中华分支睾吸虫虫卵与寡核苷酸池混合温育，以去除未结合的非特异性序列，通过重复多轮筛选，最后筛选获得了两个具有较强稳定性并能与日本血吸虫虫卵表面特异性结合的核酸适配体LC6和LC15，可用于体外检测日本血吸虫的虫卵，另外，结果表明LC15还可以识别肝肠组织中的日本血吸虫虫卵。这种能特异性结合于宿主组织内血吸虫虫卵的核酸适配体，为探索建立一种新型血吸虫病精准诊疗方法提供了新的平台，在此基础上利用纳米金等新材料及将SELEX技术与ELISA、定量PCR等结合，以及进一步探索研究筛选具有高特异性和亲和力的其他血吸虫相关核酸适配体，不断提高其特异性和亲和性以及现场血吸虫病检测和诊疗的实用性，可望用于血吸虫病的精准诊断和疗效考核，为探索开发血吸虫病新型诊疗方法提供了新的途径。

Ramos等［28，29］筛选鉴定了两个能识别重组和内源利什曼原虫裂解物H2A和H3蛋白的适配体AptLiH2A1和AptLiH2A2，为进一步探索开发新的利什曼原虫诊断技术提供了新的方法。Guerra等［30］筛选获得了三个针对利什曼原虫poly（A）结合蛋白（PABP）具有较高特异性亲和力的适配体ApPABP3、ApPABP7和ApPABP11，其中ApPABP11主要靶向利什曼原虫poly（A）结合位点可影响蛋白质的合成，可能为一种有希望的治疗利什曼病新的途径。

Hall等［21］使用多西环素诱导系统筛选了一种含有BRC蛋白基序的RNA适配体，在体内可增加DNA损伤的敏感性和抑制布氏锥虫（T.brucei）的增殖。利用传送内聚体如多肽适配体进入细胞核可有效隔离靶标并影响寄生虫的存活，1μmol／L的针对锥虫的RNA适配体能抑制50% ～70%锥虫的入侵，提供了一种有希望的新的防控途径。de Araujo FF等［31］报道基于适配体为主检测疾病生物标志物的新方法还有望用于新药对美洲锥虫病（Chagas）疗效的评估。

CFIm25是一种能与poly（A）聚合酶相互作用的RNA结合蛋白，Pezet等［32］筛选了识别CFIm25的适配体，利用溶组织内阿米巴的高吞噬能力，引入这些特异识别CFIm25的RNA适配体以阻断内源性CFIm25，这些内聚体可能影响mRNA的翻译、多聚腺苷酸化及其稳定性，改变蛋白质的合成而影响阿米巴的生存和增殖，以及其毒力特性，使其成为一种有前途的治疗阿米巴的途径。Cheng等［33］在小鼠外周血管中注射核酸文库，利用体内SELEX方法分离获得了定位于大脑组织的适配体，表明适配体可以通过血液迁移到达特定器官或部位，提示类似的方法可用于筛选那些具有增强对寄主细胞或者寄生虫本身渗透的适配体以用于寄生虫病的防控。细胞穿透肽（Cell penetrating peptides，CPA）是短的阳离子多肽具有通过细胞膜的能力，Lehto等［34］利用其作为细胞内运输载体，证实CPA能促进适配体进入靶细胞，表明利用适配体-CPA结合物可将适配体转运至靶标寄生虫或进入寄生虫感染的细胞以用于寄生虫病的诊断和治疗。

五、讨论

与传统抗体相比，核酸适配体具有特异性和稳定性高、免疫原性低不易引起机体的免疫反应、可批量生产成本低且各批次间无差异、可耐受较大范围的酸碱度和温度等易于存储、易于修饰改造并能与各种载体结合、靶标物范围广泛、可用于病原体检测和疾病的诊断治疗及药物开发等众多优点。SELEX技术自问世之日起就一直成为了研究的热点，并取得了令人鼓舞的进展，核酸适配体已发展成为现代分子医学中一种非常有希望的替代诊疗工具。在细菌、病毒及寄生虫等生物医学领域的研究结果表明，适配体对疾病的诊断、治疗以及药物疗效的评价等方面均具有重要作用。特别是一些SELEX衍生技术的发展，使适配体作为新型检测、诊断和治疗方法逐渐变为现实，其显示出的优势被逐渐作为抗体试剂的替代或补充［35］，尤其是基于核酸适配体的可视化检测方法具有简单、快速、灵敏、肉眼可见等诸多优势，使其在检测、诊断和治疗等方面具有广阔的应用前景。

要获得对靶标具有更高亲和力和特异性的适配体在于不断探索发展新的SELEX筛选技术。现阶段，筛选适配体技术的效率还不是很高，为提高检测灵敏度和扩大应用范围，今后需要进行更深入地开发和研究新型筛选技术，提高筛选效率，筛选出更多靶标对应的适配体，尤其需要进一步关注非常关键的高亲和力、高特异性适配体的筛选，提高适配体可视化的检测范围，加快核酸适配体在新型检测、疾病精准诊断与治疗等方面的应用［36，37］。目前核酸适配体荧光探针在生物医药的应用刚刚起步，是一门新兴学科和交叉领域，今后需要进一步加强核酸适配体荧光探针在生物标志物等方面的应用研究，以便用于早期诊断，提高治疗效率。

总之，核酸适配体在生物医学领域具有巨大的应用潜力，随着研究的深入发展适配体技术将发挥更加深远的影响和作用。今后需要进一步开展适配体新型筛选技术的研究，研发安全有效的新型药物，设计靶标导向精准的治疗方案和措施，发展快速敏感的诊断试剂盒等，大力推动核酸适配体研究尽快走向现场和临床实际应用，系统探索开发利用核酸适配体新技术进行疾病新型检测、精准诊断和治疗方面的应用研究，突破关键技术，发展具有原始创新和临床应用价值的疾病诊疗新方法和新技术，真正造福人类社会。