一种改良的大鼠脑脊液抽取方法

段正昊，杨童雅，吕捷，金宏杰，李金科，朱啸禹，姜雨杉，张旭

（中国医科大学基础医学院解剖学教研室，沈阳 110122）

脑脊液是由脑室中脉络膜产生的一种无色澄清透明的液体，分布于各个脑室以及蛛网膜下腔中［1］。脑脊液成分和性状的改变，可以反映中枢神经系统的病变情况和脑组织代谢功能异常。因此，脑脊液被广泛应用于生物化学、药理学、神经解剖学等研究领域中。动物实验中，大鼠是常用的实验动物之一。相关文献［2］报道，体质量为300 g左右的大鼠其脑脊液总体积大约为580 μL，可以抽取的脑脊液体积所占比重更少。且大鼠脑室内血管丰富，管腔狭小，这极大地增加了抽取脑脊液的难度［3］。因此，脑脊液抽取的成功率过低是很多初次抽取大鼠脑脊液的科研工作者面临的首要问题。本文介绍了一种操作简单且适用于初学者的脑脊液抽取方法，为相关科学研究工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料

体质量270～300 g的雄性SD大鼠（购自辽宁长生生物技术有限公司）45只，75%乙醇，1 mL注射器，大鼠脑立体定位仪，眼科剪，镊子，止血钳，手术缝合线。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组：将45只大鼠随机分为3组，每组15只，分别采用直接穿刺小脑延髓池法、经枕骨大孔穿刺法、经皮穿刺小脑延髓池法抽取脑脊液。

1.2.2 大鼠脑脊液的投抽取：大鼠用10%的水合氯醛（0.35 mL/100 g）进行麻醉，待大鼠四肢肌张力消失，或对疼痛刺激无明显反应时，剪毛，消毒。大鼠脑脊液抽取完成后，缝合肌肉和皮肤，正常饲养，观察术后存活情况。

1.2.2.1 直接穿刺小脑延髓池法 将大鼠固定在大鼠立体定位仪上，用眼科剪在大鼠两耳之间做1.5～2.0 cm水平切口，然后在切口正中处，向尾侧做2.0～2.5 cm垂直切口，使其呈T字型（图1）。用镊子撕开颈菱形肌后，暴露深层的夹肌，用眼科剪钝性剥离夹肌。剥离完成后，用眼科剪剪断夹肌肌腱的内侧二分之一（图2）。操作者用止血钳夹住夹肌断端后，松开止血钳，止血钳在自身重力作用下即可拉开肌肉，充分暴露操作视野。随后操作者用1 mL注射器在正中线枕骨棘下约3 mm处开始，向下逐渐移动针头，可找到一处软组织区域（图3），则此时针头已经触及寰枕筋膜。调整针头使坡面向上后，适当用力，有落空感后立即停止进针，缓慢抽取脑脊液，当达到100 μL左右立刻停止，快速抽出针头，将脑脊液移入1.5 mL EP管中，离心后放入-80℃冰箱里保存。

1.2.2.2 经枕骨大孔穿刺法 大鼠麻醉完成后，利用脑立体定位仪固定大鼠头部，使身体与颈部呈135°，然后参照曹远东等［4］的方法进行操作。在头颈部正中线处切开皮肤，钝性剥离背部肌肉后，暴露寰枕筋膜，在直视条件下从后外侧向小脑延髓池进针。待针头完全进入后，缓慢抽取脑脊液约100 μL。抽取完成后样品离心，放入-80 ℃冰箱保存。

图2 剪断夹肌肌腱

图3 进针手法

1.2.2.3 经皮穿刺小脑延髓池法［5］大鼠麻醉完成后，提起大鼠头部，使颈部与身体呈135°。然后在枕骨棘下缘约0.5 cm处的肌肉间隙进针，进针方向应该与大鼠身体平行，待有落空感后，缓慢回抽。取得样品后，离心，放入-80 ℃冰箱中保存。

1.3 判断标准

将收集到的脑脊液在20 min内，在室温条件下5 000 r/min离心5 min［6］，如果有血细胞沉淀，则为血性脑脊液。未收集到脑脊液或者收集到血性脑脊液，均被判定为实验失败。

1.4 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。统计各组脑脊液抽取成功的例数，计数资料的比较采用χ2检验，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 直接穿刺小脑延髓池法

15只大鼠中，从14只大鼠获得100 μL以上澄清透明的脑脊液，脑脊液抽取成功率为93.33%；剩余1只为血性脑脊液，离心后澄清透明。大鼠术后存活均在1周以上。

2.2 经枕骨大孔穿刺法

15只大鼠中，从3只大鼠获得澄清透明的脑脊液，且在100 μL以上，脑脊液抽取成功率为20.00%；8只因脑脊液外流而未获得脑脊液，4只获得血性脑脊液，离心后上清液过少。大鼠术后1周内死亡2只，其余可正常存活。

2.3 经皮穿刺小脑延髓池法

15只大鼠中，仅从2只大鼠获得澄清透明的脑脊液，其中1只不足100 μL，脑脊液抽取成功率为13.33%；10只未获得脑脊液，3只获得血性脑脊液，离心后澄清透明。大鼠术后1周内死亡5只，其余均可正常存活。

2.4 脑脊液抽取成功率的比较

直接穿刺小脑延髓池法脑脊液抽取成功率明显高于经枕骨大孔穿刺法和经皮穿刺小脑延髓池法（P＜ 0.01）；经枕骨大孔穿刺法与经皮穿刺小脑延髓池法比较，脑脊液抽取成功率无统计学差异（P＞0.05）。

3 讨论

直接穿刺小脑延髓池法是在经枕骨大孔穿刺法和经皮穿刺小脑延髓池法的基础上，进行了适当的改良。其优势如下：（1）T字形切口使手术视野和操作空间较大，易于操作者后续操作。（2）肌肉沿肌腱部分剪断，使其易于分离，手术操作可由一人完成。而且出血量较少，手术时视野清晰。（3）颈背部肌肉被剥离，使得进针深度不易被肌肉厚度干扰，针头刺破寰枕筋膜时落空感明显，易于掌控。（4）若第一次抽取失败，由于竖脊肌的封闭阻挡作用，可以使脑脊液不外流，也可以阻止外部血液污染，操作者可以调整针头方向继续穿刺。（5）大鼠术后存活率较高。

经皮穿刺小脑延髓池法是在非直视条件下进行操作，需要操作者对大鼠颈部解剖结构有详细的了解，且对进针位置和进针角度有非常高的要求。另外，小脑延髓池附近血管丰富，空间狭小，进针和抽取的时候需要用力均匀，否则很容易穿刺过深而导致出血，造成脑脊液抽取失败。因此，本方法虽然可以缩短操作时间，但却需要操作者有非常丰富的相关经验，初学者掌握较为困难。

经枕骨大孔穿刺法虽然可以在直视条件下进行穿刺，但在剥离肌肉过程中，很容易损伤血管造成大量出血，或者损伤寰枕筋膜导致脑脊液大量外流，进而导致脑脊液抽取失败。

综上所述，直接穿刺小脑延髓池抽取脑脊液具有成功率高、操作简单、动物术后存活较好等优点，且所有手术操作均在直视条件下进行，适用于无操作经验的初学者。