NEBL基因错义突变导致扩张型心肌病一家系研究

吕永楠，王京伟

扩张型心肌病(DCM)是以左心室扩大伴心功能下降为主要特征的心肌病，目前认为35%的扩张型心肌病与基因突变有关[1]。心内膜纤维弹性组织增生是罕见的心肌结构紊乱，常发生于婴儿或年轻患者，预后差[2]。目前研究发现X染色体或常染色体遗传是导致心内膜纤维弹性组织增生的可能病因[3]。Nebulin蛋白是一组肌动蛋白结合蛋白，它结合了单个肌动蛋白亚基，并参与了原肌钙蛋白的组装[4]。在心肌中特异表达Nebulin家族蛋白的是Nebulette(NEBL)基因，参与了心肌组织的早期发生及构成肌纤维组织[5-6]，NEBL基因多态性与非家族性扩张型心肌病有关[7]。本研究对1例年轻扩张型心肌病患者进行基因筛查，发现其NEBL基因突变，并对其家系成员进行了基因筛查，为早期筛查和干预扩张型心肌病提供候选基因，并进一步提示NEBL基因突变与扩张型心肌病相关性。

1 临床资料

患者，男，23岁，患者近1个月以来反复感冒，活动后自觉胸闷喘气不适，伴有乏力、心慌，活动耐量较前明显下降，患者于外院给予抗感染治疗后症状缓解不明显，近1周患者自觉上述症状加重，伴夜间不能平卧入睡。查体：T 36.5 ℃，R 18次/min，P 82次/min，BP 124/82 mmHg。神清，精神可，全身皮肤黏膜未见出血点、黄染，全身浅表淋巴结未及肿大，颈静脉无怒张，颈软，双肺呼吸音清，右下肺可闻及湿啰音。HR 82次/min，律齐，未闻及明显杂音。腹平软，无压痛及反跳痛，肝脾肋下未及，双肾区无叩痛，双下肢无水肿。心脏超声检查：LAD 45 mm，LVDD 63 mm，RAD 40 mm，RVD 23 mm，LVEF 37%。NT-proBNP 6 732 ng/L。

经武汉大学人民医院伦理委员会批准后，先证者及其家属成员均知情同意并签署知情同意书，然后进行血液标本收集，相关操作均符合伦理委员会要求和赫尔辛基宣言。详细询问先证者及其家属成员病史、家族史，根据患者描述，制作患者家系系谱图，对先证者进行体格检查、血液指标、心脏超声和心电图等检查，对家族成员行心脏超声检查。由武汉大学人民医院临床分子诊断中心对先证者候选致病基因全外显子高通量测序，获得可疑突变后，利用Sanger测序验证家系成员是否存在可疑突变。

Ⅰ2 和Ⅰ3死亡原因不明，Ⅱ2是先证者父亲，心脏超声检查：LAD 32 mm，LVDD 46 mm，RAD 36 mm，RVD 38 mm，LVEF 60%。Ⅱ3是先证者母亲，心脏超声检查：LAD 30 mm，LVDD 43 mm，RAD 38 mm，RVD 33 mm，LVEF 70%。Ⅲ2是先证者弟弟，年龄13岁，目前未发病。Ⅰ1、Ⅰ4、Ⅱ1、Ⅱ4目前体健，未发现扩张型心肌病，见图1。

注：□正常男性；○正常女性；■已故男性死因不明；●已故女性死因不明；患病男性；→先证者

图1 先证者及其家系图

候选基因筛查结果：实验室对受检者外周血提取基因组DNA采用Life technologies公司Ion PGM高通量测序仪检测ACTN2，LMNA，NEXN，PCSK9，PSEN2，TNNT2，TWIK-1，ANKRD1，BAG3，LDB3，MYPN，NEBL，RBM20，VCL，CRYAB，CSRP3，MYBPC3，MYL2，PKP2等65个遗传性心肌病相关基因，并使用Ion Reporter数据分析软件对测序结果进行分析，受检者共发现525个变异，通过分析ClinVar数据库、UCSC数据库Common SNPs、dbSNP数据库及1000-genome-project MAF小于等于1%的罕见突变，滤除无功能的同义突变和内含子突变，发现5个候选有害或可能有害突变位点进行OMIM数据库检索、HGMD数据库检索及PubMed数据库文献分析，初步认为NEBL基因的p.Ser429Leu变异，GATAD1基因的p.Thr71fs变异，与受检者扩张型心肌病关系可能性最大。经Sanger测序验证，NEBL基因的p.Ser429Leu变异为真性变异, GATAD1基因的p.Thr71fs变异为假性变异，见表1。

家系成员Sanger测序结果：根据先证者候选基因筛查结果，对获取的家族人员血液标本进行NEBL c.1286C>T(p.Ser429Leu)测序，结果提示Ⅱ2和Ⅱ3是突变基因携带者，见图2。

图2 Sanger法序列验证先证者和家系成员结果

2 讨 论

扩张型心肌病的遗传模式主要表现为常染色体显性遗传，但少部分也存在其他遗传模式如常染色体隐性遗传、X连锁遗传和线粒体DNA遗传。其中约75%的扩张型心肌病患者都集中在TTN、MYH7、MYBPC3、LMNA、SCN5A、TNNT2、TNNI3、MYH6和PLN等基因[8-10]。但本研究通过基因测序发现，本例年轻扩张型心肌病患者存在NEBL基因突变，是较为罕见的致病基因。

表1 先证者基因突变结果

目前研究发现心肌病患者中编码心肌结构蛋白基因突变，尤其是编码细胞骨架和肌动蛋白，包括Z盘蛋白，可能是导致扩张型心肌病发生最终的共同通路[11]。NEBL是肌小节Z盘蛋白，通过与肌动蛋白和原肌钙蛋白复合物相互作用从而参与心肌机械传感和心肌收缩。因此，NEBL基因突变是扩张型心肌病致病基因之一。

Purevjav等[12]研究发现扩张型心肌病患者中NEBL基因突变(K60N、Q128R、G202R和A592E)中发现肌小节和Z盘表达异常，会导致患者出现一系列心脏表型和不同的疾病严重程度，以及不同程度的心脏功能损害的临床表现。

Maiellaro-Rafferty等[13]研究证实，在NEBL转基因小鼠动物试验中，NEBL基因突变是心肌结构和机械改变导致心肌动力学改变的早期标志。研究还发现处于潜伏期的小鼠DCM模型，NEBL基因突变导致肌钙蛋白表达和定位异常，会显著影响钙离子调控和机械压力反应。

本研究中发现先证者存在NEBL基因突变，突变位点位于 c.1286C>T(p.Ser429Leu)。患者症状、实验室检查和心脏超声均提示DCM伴有心功能不全，NEBL基因c.1286C>T(p.Ser429Leu)突变为错义突变，先证者、Ⅱ2和Ⅱ3均是此基因的携带者，但是Ⅱ2和Ⅱ3目前无明显症状，心脏超声检查未发现心脏腔室结构异常和功能下降，可能为遗传异质性导致，但是相关研究提示NEBL基因突变具有潜在发展为DCM可能性，对于Ⅱ2和Ⅱ3应该定期行心脏超声检查或心脏MR检查评估心脏腔室结构，以利于早期干预患者，延缓病情进展。

遗传因素在DCM病理发展过程中起到重要的作用，特别是年轻患者，从基因水平寻找DCM发病机制具有重要的意义，能够早期辅助临床诊断疾病，并预测该患者临床预后，制定个体化诊疗方案，将为基因诊断和治疗DCM开辟新的途径。但是目前临床实践中，基因检测仍然面临着许多问题和挑战，如基因型和表型之间的差异，随着新一代基因检测技术的发展，分子遗传的研究将有助于明确基因型和表型之间的关系。