益脉颗粒治疗动脉粥样硬化的实验研究※

李芮 姚莉* 刘晓明 徐学敏 王楠 孙丰雷 张洋

（1 山东中医药大学附属医院老年医学科，山东 济南 250014；2 德州市第二人民医院内一科，山东 德州 253000；3 山东中医药大学，山东 济南 250000）

动脉粥样硬化（AS）是心脑血管疾病的共同病理基础。近年来的研究认为内皮损伤及慢性炎症反应在动脉粥样硬化发生、发展过程中起着重要的作用。AS发生的始动环节是血管内皮细胞（VEC）损伤，VEC损伤后可表达黏附分子，后者可使单核细胞与血管内皮细胞相互粘附，从而促进了AS的发展［1］。因此，研究内皮细胞功能及代谢的变化对探讨AS的发病机制有重要意义［2］。益脉颗粒以黄芪、丹参、绞股蓝、红景天、鬼箭羽组方，已经临床观察证实益脉颗粒可以降低颈动脉内中膜厚度、延缓动脉粥样硬化进程，治疗气虚血瘀型心脑血管疾病安全而有效。本实验通过观察益脉颗粒对实验性兔血脂水平、病理学以及LOX-1蛋白及基因表达，旨在氧化应激方面深入细致探讨益脉颗粒保护血管内皮、抗动脉粥样硬化的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 健康的雄性新西兰兔24只，称重（2.02±0.08）kg，由山东省农科研究院提供。

1.2 实验仪器及试剂（1）光学显微镜、全自动生化分析仪：日本Olympus公司；（2）石蜡切片机、包埋机、荧光正置显微镜：德国Leica公司；（3）病理图象分析系统（Image-Pro Plus 5.0）：Media Cybernetics Co.Ltd.USA；（4）DAB Detection Kit：北京中杉金桥生物技术有限公司；（5）LOX-1抗体：美国Abcam公司；（6）手术显微镜、全自动脱水机、PCR仪；（7）麻醉剂：戊巴比妥钠溶液。

1.3 实验药物 益脉颗粒，由山东博康药业有限公司加工。

2 实验方法

2.1 建模 将24只健康雄性新西兰兔，随机分为3组，每组8只，第1组为高脂组，饲以高胆固醇饮食（5%的猪油颗粒饲料加1%的胆固醇）；第2组作为中药组，给予益脉颗粒（1 g·d-1·kg-1）并予高胆固醇饮食（5%猪油颗粒饲料加1%的胆固醇）；第3组为正常对照组，饲正常饮食。3组均喂养4个月。

2.2 采样及处理标本 兔子被处死前禁食12 h，从兔耳缘静脉采血10 mL，以3400 r/min离心，取血清，存放于－20℃待用。将兔麻醉并固定于手术台（麻醉方法：使用浓度为3%的戊巴比妥钠溶液按照1 mL/kg注射到兔耳缘静脉），打开兔的胸腔，剥离出胸主动脉后去掉多余组织，置于4%的多聚甲醛中固定，等待备用。将固定的胸主动脉取出，持续清洗直至干净，将血管切成长约5 mm的组织块，放入石蜡包埋机包埋，等到石蜡完全浸入组织块，冷却凝固后完成。包埋好的组织块变得坚硬，切成3～5 mm厚的包切片。等待实验观察。

2.3 观察指标（1）测定TC及LDL-C水平采用全自动生化分析仪和生化测定试剂盒，测定总胆固醇（TC）水平和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平，单位用mmol/L表示；（2）使用HE染色观察血管病理形态学指标。图象分析使用软件Image-Pro Plus 5.0；（3）免疫组织化学染色观察LOX-1蛋白表达。使用显微照相系统观察LOX-1（阳性呈现棕黄色），照相；（4）实时定量PCR反应检测。使用Trizol抽提RNA，取细胞总RNA 1μg进行RT-PCR，加入10μM Oligo dT、总RNA1ug和DEPC水8μL，混合均匀，在70℃的水中放置5 min，然后迅速降温2 min，再按照顺序加入5×M-MLV reaction buffer 5μL+DEPC水补足混合均匀。混合RT体系，离心，在40℃左右水中放置1 h以合成cDNA。RT-PCR反应体系：SYBR Green Primix Ex Taq 10μL；forward primer 1 uL；double distilled water 6μL；RT cDNA 2μL；reverse primer 1μL（总共20μL）。

2.4 统计学方法 采用SPSS软件进行数据结果分析，数据以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 3组兔血脂比较 高脂组TC水平（36.65±0.31）mmol/L明显高于中药组（27.00±0.53）mmol/L和正常对照组（0.84±0.03）mmol/L（P＜0.05），高脂组的LDL-c（14.09±1.12）mmol/L也明显高于中药组（10.04±0.68）mmol/L及正常对照组（0.67±0.99）mmol/L（P＜0.05）。见表1。

表1 3组兔血脂比较（±s，mmol/L）

表1 3组兔血脂比较（±s，mmol/L）

注：中药组与正常对照组和高脂组比较，☆P＜0.05

3.2 治疗后3组兔血管病理形态学变化 正常对照组在肉眼观察下未发现AS斑块，在镜下可以见到完整的内膜。中药组在肉眼观察下可以看到粥样硬化斑块，分布在动脉的内膜上，与高脂组相比，斑块的面积减小，内膜增厚。在肉眼观察下，高脂组的动脉内膜上有脂质附着，说明AS病变已经形成。见表2。

表2 3组兔血管病理形态学分析比较（±s）

表2 3组兔血管病理形态学分析比较（±s）

注：中药组与其他2组相比，＊P＜0.05

3.3 3组兔LOX-1蛋白表达 通过免疫组化染色定量分析，中药组的LOX-1的蛋白分布较稀疏，而高脂组LOX-1的蛋白分布较密集，提示益脉颗粒可能抑制LOX-1蛋白的表达。见表3。

表3 3组兔LOX-1蛋白表达比较（±s）

表3 3组兔LOX-1蛋白表达比较（±s）

注：中药组与高脂组比较，■P＜0.05；“-”表示正常对照组LOX-1未测出

3.4 3组兔LOX-1基因发达 中药组LOX-1基因表达低于高脂组（P＜0.05），说明益脉颗粒可以抑制LOX-1基因的表达。见图1。

图1 3组兔LOX-1基因表达

4 讨论

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS） 是以血管内皮损伤、血小板病理性聚集及炎症反应等多种因素共同参与的病理过程。正常的内皮细胞可以调节血管的紧张度，参与凝血过程，同时具有较强的抗炎作用［3］。高脂血症是公认的动脉粥样硬化诱发原因之一，高脂使氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL） 异常聚集、分解障碍。血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1（lectin like oxidized low densitylipoprotein receptor-1，LOX-1）作为氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）特异性受体，主要在血管内皮表达。LOX-1参与ox-LDL降解过程，是AS形成的受体之一，血脂正常时，体内含量很少。冠状动脉及颈动脉由于其解剖结构使得血管内皮容易损伤，进而脂质沉积，最终形成动脉粥样硬化，是心脑血管病潜在危险因素。同时受损的内皮细胞NO合成减少，黏附分子表达相应的增加，引发内皮的炎症反应和氧化应激，加速内皮的损伤。

中医认为，膏脂在体内异常堆积，其病位在脾，与肝、肾有着密切的相关性。本病多因嗜食肥甘，损伤脾土，或者因肝气郁结、气机不畅，或者因肾虚鼓动无力，终致清气不升、浊气难降，中焦气机郁滞，酿生痰湿，化为脂膏，壅滞于脉中则发为本病。因此在中医临证过程中，提出动脉粥样硬化为“虚、毒”致病的观点。其中“虚”为先后天之本亏虚，即脾气不足、肾气暗耗，“毒”为致病之邪气，包括痰毒、瘀毒，在“毒损脉络，损络生毒”的理论基础上，以益气活血、化湿解毒为治疗原则，自拟“益脉颗粒”，其药物组成为黄芪、丹参、绞股蓝、红景天、鬼箭羽。其中黄芪为君药，其为补气之要药，归脾、肺经，具有补益中土、温养脾胃之功效。黄芪温补脾土，脾气得升、脾阳复辟，而中州之大气斡旋矣。而邹澍在《本经疏证》中指出：“黄芪直入中土而行三焦，故能内补中气，中行营气，下行卫气……。”黄芪一源三派，疏三焦之根，利营卫之气，故凡营卫间阻滞，无不尽通。所谓源清流自洁者也。丹参为臣药，味苦，微寒，具有凉血活血、化瘀通络的功效，使得瘀血化、新血生、脉络通。绞股蓝，始载于《救荒本草》，具有益气、安神、清热解毒、化湿祛痰的功效；红景天，具有抗脑缺氧、抗疲劳、活血止血、化瘀消肿、解热退烧、滋补元气等功效；鬼箭羽，其名始载于《神农本草经》，具有破血通络，解毒消肿的功效，三药共为佐药，以协助君药补虚、臣药活血之作用，同时进一步化湿、祛痰、解毒，以期清除脉管内蓄积的痰、瘀、毒邪。本方五药合用，使得虚得补，邪得清，气血和，阴阳平。

总之，从临床疗效及实验研究这2个不同的手段及层面进一步证明，在动脉粥样硬化早期阶段，益脉颗粒可以明显地抑制动脉粥样硬化LOX-1的蛋白表达和基因表达，改善内皮功能，抗动脉粥样硬化，且临床疗效显著。