小麦种子萌发耐高铵胁迫的基因型差异

刘 扬,梁智慧,孙淑珍,田中伟,戴廷波

(1.南京农业大学农学院/农业部作物生理生态与生产管理重点实验室/江苏省现代作物生产协同创新中心,江苏南京 210095; 2.石河子大学农学院/新疆兵团绿洲生态农业重点开放实验室,新疆石河子 832000;3.江苏省淮安市淮安区农业技术推广中心,江苏淮安 223200)

传统评定作物品种抗逆性的方法多以产量为标准，但其周期较长，受环境影响较大。萌发期是作物生长发育的基础阶段，也是产量形成的关键时期。在萌发和萌发后苗期室内鉴定品种的抗逆性差异不仅可以有效控制外界环境因素，还具有时间短，容量大，重复性强等优点。本研究拟通过水培试验方法，筛选适宜的小麦种子萌发高铵胁迫临界浓度，并在此基础上系统评价不同小麦品种对高铵胁迫响应的差异，为小麦耐高铵基因型的筛选及其生化机理研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验设计

1.1.1 高铵胁迫临界浓度的筛选

1.1.2 高铵胁迫临界浓度点验证

1.1.3 抗高铵胁迫品种的筛选

以筛选的高铵胁迫临界浓度于2013年9月和11月进行耐高铵品种筛选试验。供试材料为不同年代育成的24个小麦品种，包括：南大2419、火烧头、小偃4号、江东门、丰产3号、扬麦1号、豫麦13、宁麦13、扬麦13、宁麦9号、烟农19、豫麦49、郑麦9023、扬麦11、扬麦158、镇麦9523、苏麦6号、徐州25、鲁麦15、矮抗58、淮麦25、金禾9123、扬麦16 。水培容器为塑料纱网特制的培养周转箱(310×210×110 mm)，选取籽粒饱满、均匀的小麦种子，用20% H2O2浸泡10 min，蒸馏水冲洗干净后，置于距周转箱底部6 cm纱网上，于光暗比12 h/12 h(24/16 ℃)培养。分别用850 mL含筛选的高铵胁迫临界浓度和对照(CON)的Hoagland营养液进行培养，其离子成分与1.1.1相同。每个处理设4个重复，每天更换一次营养液，并用1.0 mM NaOH调pH至 6.8～7.0。处理7 d后取样，测定形态指标。

1.2 测试项目与方法

1.2.1 植株形态及干重测定

处理7 d后，取20颗发芽的种子，分别测定胚根和胚芽鞘长度后，将其分为胚芽鞘、根系和种子剩余物三部分，105 ℃杀青30 min，70 ℃ 烘干至恒重，计算不同部位的干物质量。

1.2.2 主要贮藏物质含量和α-淀粉酶活性测定

称取1.2.1中烘干样品0.1 g，加8.0 mL 80% 的乙醇于10 mL离心管中，摇匀；80 ℃ 水浴30 min，3 000 r·min-1离心10 min，取上清液于25 mL容量瓶中，乙醇提取重复3次，定容至25 mL；可溶性糖含量采用蒽酮法[12]测定；游离氨基酸含量采用Moore方法[13]测定；总淀粉含量和α-淀粉酶活性分别采用茚三酮比色法[14]和3,5-二硝基水杨酸法[15]测定。

1.3 数据分析

采用耐铵指数[16]衡量不同基因型的耐高铵性。

耐铵指数 = 高铵胁迫下的测定值/硝处理下的测定值。

数据采用EXCEL和SPSS 10.0进行分析；图表采用Sigmaplot 10.0绘制。

2 结果与分析

2.1 小麦高铵胁迫临界浓度的筛选

随着铵浓度的升高，种子发芽率、胚根长度、根数、株高、胚芽鞘和胚根干重逐渐下降(表1)。与CON相比，铵浓度 <5.0 mM各处理的种子发芽率、株高和胚芽鞘干重虽下降，但无显著性差异；铵浓度>5.0 mM各处理的被测指标均与CON差异显著。因此，确定高铵胁迫临界浓度为5.0 mM。由表2可知，与CON相比，5.0 mM铵胁迫下，株高和胚芽鞘干重降低幅度远小于胚根长度和干重降低幅度，说明根系对高铵胁迫更敏感。

表1 不同铵浓度处理对小麦种子萌发的形态学影响

同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。下同。

Different small letters following data in same column mean significant difference among treatments at 0.05 level.The same in tables 2 and 5.

表2 高铵胁迫对小麦种子萌发的形态学影响

2.2 高铵胁迫对小麦萌发相关生理指标的影响

随着萌发时间的延长，铵胁迫与CON处理扬麦13萌发种子内α-淀粉酶活性趋势不尽相同，前3 d均上升且处理间差异不显著；萌发3 d后，高铵胁迫较CON处理显著降低了扬麦13萌发种子内α-淀粉酶活性。随着萌发时间的推进，萌发种子内淀粉含量逐渐下降，在萌发3 d后，高铵胁迫处理的种子内淀粉含量显著高于CON处理。种子内可溶性糖随萌发时间推移呈先升后降趋势，在第5天和第7天时，处理间差异达到显著水平，游离氨基酸含量随着萌发时间的推进逐渐增加，在萌发第7天时差异显著(图1)。

* 表示两种处理间在P<0.05水平差异显著。

* means significant difference between treatments at 0.05 level.

图1 高铵胁迫对小麦种子萌发贮藏物质动员的影响

Fig.1 Effect of elevated ammonium nutrition on storage matter mobilization during wheat seed germination

2.3 高铵胁迫对小麦萌发相关形态指标的影响

由表3可知，铵胁迫与CON处理间，6个形态指标的差异均达到极显著水平。两种氮形态下，胚根干重、胚芽鞘干重、植株干重和根冠比均具有较大变异(变异系数 > 10%)。与CON处理相比，EAN处理提高了小麦的胚根长度、胚根干重和根冠比变异系数，说明根系对高铵胁迫更加敏感。

表3 不同处理下小麦种子萌发相关指标的差异

同行数据后不同的大写字母表示两种处理间差异在P<0.01水平显著。

Values followed by different capital letter mean significant difference between treatments at 0.01 level.

2.4 小麦耐高铵基因型筛选

将6个指标的耐铵指数进行相关性分析表明，胚根长度耐铵指数与胚芽鞘长度耐铵指数的相关性达到显著水平；胚根干重耐铵指数与植株干重耐铵指数相关性达到极显著水平，与根冠比耐铵指数呈显著相关；胚芽鞘长度耐铵指数与胚根干重、根冠比耐铵指数的相关性达到极显著水平，与植株干重耐铵指数呈显著相关；胚芽鞘干重耐铵指数与植株干重和根冠比耐铵指数相关性达到极显著水平(表4)。以胚根长度、胚芽鞘长度、植株干重和根冠比耐铵指数为指标，经归一化处理后采用离差平方和法进行聚类分析(图2)。将24个小麦品种划分为三类：高铵敏感型、中间型和耐高铵型。其中，高铵敏感型品种以火烧头、镇麦9523，鲁麦15等品种为代表；中间型以宁麦9号、小偃4号、南大2419等品种为代表；耐高铵型以豫麦49品种为代表。进一步分析表明，除根冠比耐铵指数在中间型和耐高铵型类群中差异不显著外，其他指标在三个类群中差异均显著(表5)。综上，在高铵胁迫浓度为5.0 mM条件下，可以将胚根长度、胚芽鞘长度、植株干重和根冠比作为耐高铵胁迫基因型的筛选指标。

表4 小麦不同指标耐铵指数的相关性

RCL:胚芽鞘长度耐铵指数; RRL:胚根长度耐铵指数; RRDW:胚根干重耐铵指数;RCDW:胚芽鞘干重耐铵指数;RRSDW:剩余种子干重耐铵指数;RPDW:植株干重耐铵指数; RRSR:根冠比耐铵指数。下同。

RCL:Resistance ammonium index of coleoptile length;RRL:Resistance ammonium index of radicle length; RRDW:Resistance ammonium index of radicle dry weight;RCDW:Resistance ammonium index of coleoptile dry weight; RRSDW:Resistance ammonium index of remaining seed dry weight; RPDW:Resistance ammonium index of plant dry weight; RRSR:Resistance ammonium index of root/shoot ratio.The same in table 5.

图2 24个小麦品种的系统聚类图

表5 耐高铵胁迫的类群间差异

Table 5 Difference between two clusters in elevated ammonium nutrition tolerance indices

类型 TypeRRLRCLRRDWRCDWRPDWRRSR耐高铵型Resistance0.575a0.967a0.779a0.974a0.921a0.893a中间型Moderate0.508b0.921b0.710b0.885b0.876b0.848b高铵敏感型 Sensitivity0.447c0.881c0.622c0.820c0.804c0.834b

3 讨论与小结

3.1 高铵胁迫临界浓度的确定

植物生长受环境因子影响与限制，当某种因子超出植物生长所能承受的范围时，会对植物产生胁迫作用。铵是植物生长的重要氮源之一，是参与植物生理生化过程的重要离子。随着铵浓度的升高，植物受胁迫程度加剧。研究发现，低浓度铵(≤0.05mM)对植物生长发育有促进作用，而高浓度铵(5.0mM)抑制植物生长，表现在抑制种子萌发，降低根系生长速率和叶面积、叶片含水量和光合速率[5,7,17-19]，与本研究结果一致。在拟南芥不同突变体对铵营养响应的研究中发现，拟南芥在1.0 mM 和5.0 mM铵浓度下，初生根生长速率显著降低，与硝态氮相比，5.0 mM铵水平抑制效果显著[20-21]。本研究中，与硝态氮相比，5.0 mM铵浓度显著降低了小麦萌发期发芽率、胚根长度、株高、胚芽鞘干重和胚根干重、萌发种子内α-淀粉酶活性、可溶性糖和游离氨基酸含量，增加了小麦萌发种子内淀粉含量，且此浓度下种子萌发阶段被测形态和生理指标(第5天开始)均与对照差异达到显著，证明5.0 mM为小麦萌发的高铵胁迫临界浓度。

3.2 小麦耐高铵胁迫基因型筛选

植物品种对氮素营养响应的差异研究始于20世纪30年代，Schortemeyer等[22]研究发现，不同基因型玉米幼苗对20 mM铵的响应存在基因型差异。此外，在玉米、高粱、水稻、棉花、大豆和黑麦等作物上也均有这方面报道[23-24]。不同品种小麦自身存在基因型差异，本研究采用了耐铵指数(相对值)衡量不同小麦品种对铵的响应，以消除环境干扰以及品种自身生物性状的差异。

已有较多高铵胁迫对作物幼苗生长影响的研究[20,25-26]，但大部分集中在拟南芥突变体材料以及不同物种间的比较。本研究对6个萌发相关指标耐性指数进行相关性分析表明，胚根长度耐铵指数与胚芽鞘长度耐铵指数的相关性达到显著水平；胚根干重耐铵指数与植株干重耐铵指数相关性达到极显著水平，与根冠比耐铵指数呈显著相关；胚芽鞘长度耐铵指数与胚根干重、根冠比耐铵指数的相关性达到极显著水平，与植株干重耐铵指数呈显著相关；胚芽鞘干重耐铵指数与植株干重和根冠比耐铵指数相关性达到极显著水平。因此，建议以胚根长度、胚芽鞘长度、植株干重和根冠比耐铵指数作为小麦种子萌发时期耐高铵基因型的筛选指标。通过聚类分析将24个供试小麦品种划分为三类：高铵敏感型、中间型和耐高铵型。高铵敏感型和耐铵型间的6个被测指标间均呈现显著性差异。高铵敏感型品种以火烧头、镇麦9523和鲁麦15为代表；耐高铵型品种以豫麦49为代表。筛选出的耐高铵品种可以在以后的抗铵育种中作为种质材料加以应用。