骨髓活检联合多参数流式细胞术及FISH技术在慢性淋巴细胞白血病诊断中的应用

2019-11-27胡永军

国际检验医学杂志 2019年22期

金恂，胡永军

(淮安市淮安医院检验科，江苏淮安 223200)

慢性淋巴细胞白血病(CLL)是临床较为常见的老年性肿瘤疾病之一，其主要发病机制是机体B淋巴细胞发生克隆性异常增殖[1]。流行病学资料显示[2]，90%的CLL患者的发病年龄在50岁以上，男性患者发病率高于女性[3]。临床表现以贫血、出血及发热为主，病因包括环境因素、遗传性因素及病毒感染所致的免疫缺陷等。骨髓细胞形态学检查作为血液系统疾病常见检测方法，在临床中的应用越来越多。但是受到骨髓结构、增生及细胞分布情况的影响，骨髓涂片往往不能准确反映患者的造血功能[4]。多参数流式细胞术对于CLL患者的免疫分型诊断具有积极的意义。荧光原位杂交技术(FISH)对间期和分裂期细胞的诊断准确、灵敏，对患者的预后具有较好的预测功能。本研究通过对骨髓活检联合多参数流式细胞术及FISH技术在CLL诊断中的应用分析，以期为诊断和预后判断提供科学依据。

1 资料与方法

1.1一般资料选取2015年2月至2018年2月的在本院住院治疗的120例CLL患者为研究对象，依据中国CLL的诊断与治疗指南和Binet分期[5]，将患者分为A期38例，B期40例，C期42例，患者平均年龄为(54.23±1.09)岁。参考欧洲白血病免疫学会分型研究3组提倡的抗原积分系统对患者进行免疫抗原分组[6]，其中未分化型患者52例，单纯型患者24例，变异型患者22例，混合型患者22例。另选取本院健康体检的老年人120例作为对照组，两组患者的性别、年龄比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。所有患者的治疗方案均为CLL ICB-FM2002。所有研究对象家属均签署知情同意书，并通过本院医学伦理委员会论证通过。

患者纳入标准：(1)所有患者均符合CLL诊断标准[5]，外周血淋巴细胞计数≥5×109/L；(2)外周血涂片特征性表现为小的、形态成熟的淋巴细胞显著增多，其细胞质少、核致密、核仁不明显、染色质部分聚集，并易见涂抹细胞，外周血淋巴细胞中不典型淋巴细胞及幼稚淋巴细胞<55%；(3)典型的流式细胞术免疫表型为CD19+、CD5+、CD23+、CD200+、CD10-、FMC7-、CD43+，表面免疫球蛋白(sIg)、CD20及CD79b弱表达(dim)；(4)均未有肿瘤远处转移；(5)已获得患者及家属知情同意。排除标准：(1)排除严重心脏、肝、肾功能障碍患者；(2)对本研究药物过敏患者；(3)中途停止治疗或者转院患者。

1.2研究方法

1.2.1骨髓活检分别对2组患者使用骨髓活检专用针进行髂后上棘骨髓抽吸，将抽吸好的骨髓进行涂片检测。

1.2.2骨髓病理切片检测将以上获得的骨髓样品瑞姬氏染色，经bouin液进行固定，使用乙醇进行梯度脱水处理，石蜡包埋后，将患者的样本进行2～3 μm及5 μm切片，2～3 μm切片进行苏木素-姬姆萨-酸性品红染色(HGF)，5 μm切片进行gomori网状纤维银染色。

1.2.3多参数流式细胞术使用BD公司生产的FAGS Galibur型流式细胞仪对2组患者的骨髓样本进行检测，使用CELL QUEST软件进行患者的骨髓形态和免疫抗原检测。CD33抗体由上海信裕生物技术有限公司提供。

1.2.4FISH检测使用八探针FISH系统对患者进行骨髓检测，分别对2组患者的骨髓形态及核酸物质(MYC、P16、E2A、CHI2/D10Z1/D17Z1、TEL/AML1、MLL、BCR/ABL1、IGH)差异进行对比分析。实验试剂由上海起发实验试剂有限公司提供。

1.3观察指标 (1)骨髓细胞的形态学诊断：分别对比观察骨髓涂片和骨髓活检切片骨髓形态的诊断差异。(2)骨髓形态学的诊断效能比较：使用受试者工作特征曲线(ROC曲线)对患者的诊断效能进行对比观察。(3)多参数流式细胞术对患者的检测结果分析。(4) FISH技术检测结果分析。

2 结果

2.1骨髓细胞的形态学诊断比较骨髓涂片的检出率(83.33%)低于骨髓切片(100.00%)，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 骨髓细胞的形态学诊断比较

图1 骨髓形态学的诊断ROC曲线分析

2.2骨髓形态学的诊断效能对比通过对骨髓涂片和骨髓切片的ROC曲线分析，骨髓切片的诊断效能显著高于骨髓涂片，其诊断灵敏度高于骨髓涂片，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 骨髓形态学的诊断效能比较

表3 多参数流式细胞术对患者的检测结果分析

2.3多参数流式细胞术对患者的检测结果分析通过对患者进行多参数流式细胞仪检测，CLL患者中的交叉髓系抗原以CD33(33.33%,40/120)居多，其中，未分化型患者、单纯型患者、变异型患者、混合型患者均以CD33表达为主，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.4FISH技术检测结果分析通过对患者进行FISH技术检测，患者的核酸变异以CHI2/D10Z1/D17Z1多倍体(46.67%，56/120)为主，其中，未分化型患者、单纯型患者、变异型患者、混合型患者均以CHI2/D10Z1/D17Z1多倍体表达为主，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 FISH技术检测结果分析

2.5单独检测和联合诊断效能分析通过对患者的单独检测和联合诊断效能比较，3种方法联合检测诊断灵敏度显著高于单独检测，差异有统计学意义(P<0.05)，见表5。

表5 单独检测和联合诊断效能分析

3 讨论

CLL疾病是一种恶性淋巴增殖性疾病，多见于老年男性患者[2]，其中以CD5+的B细胞CLL疾病占绝大多数，约占95%[7]。目前，CLL的中位生存期大约为10年[8]，患者的预后随患者的性别、年龄及体能状态而各异。对于CLL疾病的诊断，目前临床多采用骨髓镜检方式，骨髓形态学检查是最为基本的检查手段之一[9]，骨髓涂片相对简单，骨髓细胞结构较为清晰，胞质着色较鲜艳，在白血病的分型中普遍使用，但是在对疾病的进展及预后评价中存在一定的缺陷。而骨髓切片活检，则可以准确预估患者的骨髓增生情况[10]，通过直观对患者的骨髓造血细胞的分布、定位及数量评价，综合患者间质水肿及骨小梁改变等情况，观察骨髓增生异常综合征的粒系病态，进而对患者的预后状态进行准确评价。

本研究中，骨髓涂片的检出率(83.33%)低于骨髓切片(100.00%)，同时通过对患者2种检测方法的诊断灵敏度分析，骨髓切片的诊断效能显著高于骨髓涂片，分析认为，在患者的骨髓涂片制作过程中，某些骨髓增生较低患者的取材失败率较高，患者的骨髓纤维组织也在一定程度上影响患者的取材[11]，而骨髓活检过程采取环钻法进行，有效弥补了患者涂片取材过程中的不足[12]，提升患者样本中低活跃度病变组织，在实际诊断过程中，造成患者的漏诊。通过对患者的ROC曲线分析，骨髓切片活检的诊断灵敏度显著高于骨髓涂片。杨娣娣等[13]对患者骨髓细胞形态学的涂片和活检结果对比观察显示，骨髓活检效能显著高于对照组，与本研究相互印证。

在采用多参数流式细胞术对患者的检测中，CLL患者的交叉髓系抗原以CD33(33.33%,)居多，在对患者的流式细胞术的检查中，通过对膜内抗原的检测，在骨髓形态学检测中的单纯型CLL疾病的诊断，有4例患者被免疫抗原诊断为混合型CLL疾病，证实通过对患者进行流式细胞仪检测，对患者的形态学诊断具有一定的弥补作用。董苹等[14]对CLL的诊断中，流式细胞仪检测对于CLL诊断具有一定的弥补性，与本研究相互印证。

另外，在对患者的核酸物质的检测中，通过探针原位杂交检测，患者的核酸变异以CHI2/D10Z1/D17Z1多倍体(46.67%)为主，在56例CHI2/D10Z1/D17Z1多倍体的分析中，40例患者表现为多倍体，8例患者未见分裂象，其余8例患者表现为分裂相，但是无法进行具体分析。通过本研究证实，接近50%的CLL患者均表现为CHI2/D10Z1/D17Z1多倍体变异，在实际患者的诊断和治疗过程中，可以通过对CHI2/D10Z1/D17Z1多倍体的变异情况，对患者的治疗效果及预后评价具有积极的作用。在对患者的骨髓活检和流式细胞仪检测中，有效形成互补，对于患者的个性化治疗提供重要依据。

本研究中采用骨髓涂片，通过免疫组织化学检查，对患者的核酸具有一定的特异性。通过对患者的骨髓活检，相比传统的骨髓涂片检查，对患者的核酸诊断具有显著的灵敏度。通过对患者的核酸异质性进行精准诊断，对患者的治疗方案的选择具有积极意义。