响应面优化芥末籽油的水酶法提取工艺及其脂肪酸分析

,2,*,3

(1.云南民族大学化学与环境学院,云南昆明 650500;2.云南省跨境民族地区生物质资源清洁利用国际联合研究中心,云南昆明 650500;3.民族地区矿产资源综合利用重点实验室,云南昆明 650500)

芥末(SinapisalbaL.)为十字花科植物,其成熟的种子经碾磨后得到的油为芥末油[1],它具有一种独特的味觉刺激性气味,主要为异硫氰酸烯丙酯[2],可刺激唾液和胃液的分泌,能够解腻爽口、增强食欲,有开胃作用;还富含多种脂肪酸的甘油酯,如芥酸、油酸、亚油酸和亚麻酸等,被广泛应用于制作凉拌菜、酸菜、蘸水、咖喱粉的调味品[3];另外还有解鱼蟹之毒、美容养颜等功效[4]。

芥末籽油的传统提取工艺主要为压榨和蒸馏法[5],压榨法成本高、出油率较低,且需要经热力机械处理,容易影响热敏性物质的活性,而蒸馏法同样存在出油率较低、不利于工业化生产的缺点[6]。水酶法主要在物理破碎的基础上,直接采用蛋白酶[7]、淀粉酶[8]、果胶酶[9]、纤维素酶[10]等破坏植物细胞,使油脂从破坏了的组织中被释放出来,该过程不需要有机溶剂,所提取的油脂不需要脱胶工序,也能保持油脂原有的营养价值,且设备简单、操作安全、环境友好,该法所得油脂质量高、色泽浅[11-12]、符合当代可持续发展理念。

虽然国内外已对水酶法提取花生油[13]、米糠油[14]、菜籽油等[15]展开了大量的研究,但尚未见水酶法提取芥末籽油的相关报道。本文主要研究了各因素对芥末籽出油率的影响,采用响应面分析法确定了较优的提取工艺条件,进一步采用GC-MS分析脂肪酸的组分,为芥末油的综合利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

芥末籽 购自内蒙古,碱性蛋白酶(20万U/g)、中性蛋白酶(6万U/g)、α-淀粉酶(3700U/g)、纤维素酶(140万U/g) 北京奥博星生物技术有限公司;盐酸 重庆川东化工有限公司;氢氧化钠(分析纯) 天津市风船化学试剂科技有限公司。

7890-5435气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦公司;GZX-9246M BE数显鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司;F2102型植物粉碎机 宁波双嘉仪器有限公司;PHsJ-4A实验室pH计 上海精密仪器有限公司;荣华THZ-82A水浴恒温振荡器 上海邦西仪器科技有限公司;LXJ-IIB 离心机 广丰科技有限公司;KQ-250E型超声波清洗机 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 芥末籽油水酶法提取及出油率的计算 工艺流程:芥末籽→干燥粉碎→过筛(40目筛)→配液→超声→调pH、温度→加酶酶解→高温灭酶(90 ℃,10 min)→离心分离→收集上层清油→称重→计算出油率。

准确称取芥末籽粉20 g于200 mL烧杯中,按7∶1 (mL/g)的液固比添加140 mL的蒸馏水,超声功率为80 W的条件下,于超声波清洗器中超声破壁8 min后,加入适量的酶,再用氢氧化钠调节体系的 pH,再在水浴恒温振荡器中酶解一定的时间,酶解结束后升温至90 ℃灭酶10 min,待自然冷却后,置于离心机上于5000 r/min的条件下离心12 min后,待油水层分开后,将上层油相置于分液漏斗中并加入5 mL石油醚,静置5 min,收集上层油相后,用无水碳酸钠干燥后称重,即得芥末籽油。芥末籽出油率按下式计算:

1.2.2 不同酶制剂对芥末籽出油率的影响 参照1.2.1的提取方法,在加酶量2.5%、液固比7∶1 (mL/g)、酶解时间6 h、酶解温度、酶解 pH为对应酶的适宜值的条件下,比较碱性蛋白酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶、纤维素酶和不加酶(空白)五种情况下对芥末籽出油率的影响,从而确定出适宜酶制剂。每处理组设3个重复。四种常见酶的最适pH及温度条件参见表1。

表1 四种常见酶的最适pH及温度Table 1 Optimum pH and temperature of four common enzymes

1.2.3 单因素实验 以芥末籽油出油率为指标,在总加酶量确定的条件下分别考察液固比、碱性蛋白酶酶解时间和酶解温度对芥末籽油出油率的影响。

1.2.3.1 酶解时间对出油率的影响 在酶解温度45 ℃、酶解pH10.0、液固比7∶1 (mL/g)和加酶量2.5%的条件下,考察芥末籽分别在2、4、6、8和10 h酶解时间下对芥末籽出油率的影响。每处理组设3个重复。

1.2.3.2 酶解温度对出油率的影响 在酶解时间6 h、酶解pH10.0、液固比 7∶1 (mL/g)和加酶量2.5%的条件下,考察芥末籽在41、43、45、47和49 ℃的酶解温度下对芥末籽出油率的影响。每处理组设3个重复。

1.2.3.3 液固比对出油率的影响 在酶解时间6 h、酶解温度45 ℃、酶解pH10.0和加酶量2.5%的条件下,考察芥末籽在4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1和9∶1 (mL/g)的液固比条件下对芥末籽出油率的影响。每处理组设3个重复。

1.2.4 响应面优化出油率实验 以实验中的液固比、酶解温度和酶解时间3个因素为自变量,以芥末籽出油率为响应值,以-1、0、1代表因素水平编码,采用Design Expert软件进行实验设计[16],根据CCD设计原理,液固比、酶解温度、酶解时间各设置3个水平,见表2。然后根据所得设计结果再次进行实验优化,对优化后的实验结果进行响应面分析,获取所需实验数据。

表2 Box-Behnken实验设计因素水平Table 2 Factors and level of response surfaceoptimization in Box-Behnken design

1.2.5 酶解芥末油中脂肪酸组成的GC-MS测定 甲酯化:称取水酶法所得芥末油1 mL于圆底烧瓶中,加入10 mL甲醇—氢氧化钠(体积比为10∶1)溶液,于8O ℃恒温水浴锅中加热反应20 min后冷却,用正己烷萃取2～3次,合并萃取液,蒸馏水洗涤3次,并用无水硫酸钠干燥,取上清液待测。

色谱柱:HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 um)毛细管柱,载气为高纯度的氦气,流速为1 mL/min;程序升温为初始温度40 ℃保持3 min,以5 ℃/min升温至300 ℃,恒温3 min。进样量0.1微升,进样口温度280 ℃。

质谱条件:EI离子源温度为230 ℃,电子能量70 eV,接口温度230 ℃,发射电流为36.4 uA,溶剂延迟0.2 min,采用峰面积归一化法进行半定量分析,确定芥末油中的种类和相对含量。

1.3 数据处理

本实验所有数值均为三次以上测定值,以平均值±标准偏差表示,实验数据均采用 Origin 8.5数据分析软件,在响应面实验设计中采用Design-Expert 8.1.6 统计分析软件,P>0.05为不显著;0.01

2 结果与分析

2.1 不同酶制剂对芥末籽出油率的影响

由图1看出,芥末籽出油率最高的是碱性蛋白酶,出油率达到21.5%,是对照组的10.75倍,是α-淀粉酶的2.38倍,说明碱性蛋白酶在芥末籽出油率中提取效果是最佳的。其中纤维素酶和α-淀粉酶的效果不佳,虽然它能够水解细胞壁的主要成分纤维素和分解细胞壁多糖,但其最适pH为酸性或中性,此条件下不利于蛋白质与油脂的分离,造成蛋白质的浪费,而采用碱性蛋白酶酶解可以破坏脂蛋白、脂小体蛋白膜的结构从而释放油脂[17],芥末籽出油率最高,故选取碱性蛋白酶进行后续实验。

图1 不同酶制剂对芥末籽出油率的影响Fig.1 Effect of different enzymeson the oil yield of mustard seeds

2.2 单因素实验结果

2.2.1 酶解时间对出油率的影响 由图2可知,酶解初期芥末籽出油率随酶解时间的延长呈现上升的趋势,当酶解时间达到6 h时,出油率最高,但6 h后,出油率反而呈现降低的趋势,这可能是酶解时间过长时,体系中的油脂溶出已经达到了动态平衡[18],说明选择合适的酶解时间既证油脂的品质,也节约生产成本,故确定适宜酶解时间为6 h。

图2 酶解时间对芥末籽出油率的影响Fig.2 Effect of enzymatic reaction timeon oil yield of mustard seeds

2.2.2 酶解温度对出油率的影响 如图3所示,当酶解温度较低时,碱性蛋白酶活性低,不利于酶解反应的进行,随着酶解温度的升高,出油率显著升高,当酶解温度达到45 ℃时,出油率最高达到了23%;但随着温度的升高,当达到49 ℃时,出油率降低到了16%。说明过高的酶解温度会导致酶变性或部分失活[19],不利于芥末籽油的提取,故确定适宜酶解温度为45 ℃。

图3 酶解温度对芥末籽出油率的影响Fig.3 Effect of enzymatic temperatureon oil yield of mustard seeds

图4 液固比对芥末籽出油率的影响Fig.4 Effect of liquid-solid ratioon oil yield of mustard seeds

2.2.3 液固比对出油率的影响 如图4所示,随着液固比的增加,芥末籽出油率也随之升高,当液固比为7∶1 (mL/g)时,出油率达到21%,之后随着液固比的增加,出油率略有下降。表明当体系中液固比较低时,物料黏度较大,流动性差,不利于酶与底物充分作用,反之,当体系中液固比较高时,碱性蛋白酶与底物的浓度均降低,分子之间彼此碰撞的几率也大大的降低[20],此时酶解不充分,故本实验确定最适宜的液固比为7∶1 (mL/g)。

表4 芥末籽出油率回归方差分析结果Table 4 Regression variance analysis results of the oil yield of mustard seed

注:*:P>0.05为不显著;**:P<0.05为显著;***:P<0.01为极显著。2.3 响应面优化实验结果

2.3.1 数学模型的建立与显著性结果 据CCD试验设计,以液固比、酶解时间和酶解温度3个因素作为自变量A、B、C,芥末籽油的出油率作为响应值R,通过Expert 8.1.6分析软件获得的实验方案及其采用该方案获得的实验结果如表3所示。

表3 CCD试验设计及实验结果Table 3 CCD test design and experimental results

由表3 CCD试验设计结果可知,响应值芥末籽出油率R与各影响因子间的回归方程为:

R出油率=21.20+2.06A+3.88B+0.69C+0.12AB-0.75AC+0.13BC-3.60A2-4.48B2_2.85C2

所得模拟方程具有较好的相关性,相关系数为R2=0.9238。此外,对回归模型进行了方差分析,结果如表4所示。

建立模型的P<0.01,具有极显著性,失拟项的P=0.1075>0.05,无显著性,由此可见,所建模型可用于芥末籽出油率的响应面分析。此外,A、B、A2、B2、C2项的P值均小于0.05,表现出显著性,这表明液固比、酶解温度、酶解时间均为提取芥末籽油过程中影响出油率的主要因素,其中B、A2和B2项的P<0.01,即液固比和温度对出油率的影响极为显著,而A和C2的P<0.05,表明液固比和酶解时间的影响效果要弱于酶解温度。AB、AC、BC项中,P值均大于0.05,这表明以上三个因素对芥末籽出油率的影响交互作用不显著。

2.3.2 响应面分析 通过Expert 8.1.6分析软件对表3中的数据进行二次多元回归拟合,交互作用显著的响应面等高线图如图5所示,3组图很直观的反映了液固比、温度和时间对芥末籽出油率的影响。

图5 各因素及其交互作用对水酶法提取影响出油率的响应面图Fig.5 Response surface diagram of each factor and its interaction effect on mustard oil extraction with enzyme

图5显示了A(液固比)、B(酶解温度)和C(酶解时间)3个因素对芥末籽油出油率的等高线图(a、c、e)和3D响应面图(b、d、f)。图5a中沿着B因素(酶解温度)向峰值方向移动,其等高线的密度明显高于沿A因素(液固比)方向,则酶解温度对芥末籽出油率的影响更为显著,由对应的3D响应面图(图5b)也能获取相同的结果,在A因素方向,响应面曲线较为平缓,液固比对芥末籽出油率的影响较小,说明酶解温度对出油率的影响大于液固比。

图5c和5d也显示了A因素(液固比)和C因素(酶解时间)有明显的交互作用。在等高线图中,沿着C因素向峰值方向移动的等高线密度要相对低于沿A因素方向。3D响应面图(图5d)显示在A因素方向响应面曲线有一定的坡度,在C因素方向,响应面曲线较为平缓,因此,液固比对出油率的影响大于酶解时间。

由图5e和图5f看出B因素(酶解温度)和C因素(酶解时间)的交互作用同样具有显著性。由两因素沿峰值方向的等高线密度及与之对应的3D响应面(图5f)的陡峭程度可以看出,B、C两因素对芥末籽出油率的影响也存在较大差异,酶解温度的影响更为显著。综合分析可以发现,3个因素对芥末籽出油率的影响有所不同,其影响程度大小为:酶解温度>液固比>酶解时间。

通过响应面分析试验对芥末籽出油率进行了优化分析,得到的最优条件为:酶解温度为45 ℃、液固比为7∶1 (mL/g)、酶解时间为6 h时,预测的最优芥末籽出油率为21.2%,通过3次实验检验最优预测条件下的提取效果,芥末籽出油率达到了(23%±0.58%),与预测值相差2.8%,总体接近预测值,说明该响应面分析模型下得到的最佳工艺条件具有较高的可靠性。

2.4 芥末油脂肪酸分析

通过气相色谱-质谱联用仪对酶解芥末油中脂肪酸进行分析,总离子流色谱图如图6所示。

图6 酶解芥末油中甲酯化产物成分的总离子流色谱图Fig.6 Total ion chromatogram of the methyl esterificationproduct components in enzymatically treated mustard oil

采用GC-MS法测定分析酶解芥末油中主要的脂肪酸的组成,并通过峰面积归一化法计算每种脂肪酸的相对含量。结果由表5所示,酶解芥末油中主要的脂肪酸是不饱和脂肪酸,相对含量高达为81.34%,饱和脂肪酸含量为6.26%;其中油酸含量高达50.72%,芥酸相对含量达到16.42%,二十碳烯酸相对含量达到13.51%。由于芥末籽的品种、产地和成熟度等都会对芥末油的化学组成有一定的影响,因此在不同的报道中对脂肪酸的组成有一定的差异。吴国欣等[21]用乙醚提取芥末籽中的芥末油,不饱和脂肪酸的相对含量高达80%以上,芥酸的相对含量为21.51%,油酸的相对含量为11.9%,亚油酸相对含量为34.8%;陈振德等[22]报道索氏提取的芥末油中不饱和脂肪酸占总量的90%以上,油酸相对含量高达19.57%,芥酸相对含量为25.56%。所以,芥末油中的高含量不饱和脂肪酸可有利于促进儿童大脑生长发育、调节血脂等,具有较高的营养价值。

表5 酶解芥末油甲酯化产物的成分分析与相对含量Table 5 Composition analysis and relativecontent of enzymatically hydrolyzed mustardoil methyl esterification products

3 结论

在水酶法提取工艺中,碱性蛋白酶是提取芥末籽油的最适酶制剂。影响出油率的因素主要为酶解温度、液固比和酶解时间。响应面法分析表明,2.5%碱性蛋白酶、pH10.0、酶解温度为45 ℃、液固比为7∶1 (mL/g)和酶解时间6 h,芥末籽出油率可达到23%。成分分析显示,该水酶法提取的芥末籽油具有较高的营养价值。