三穗鸭中磺胺类和喹诺酮类药物残留检测及风险评估

(黔东南州农产品质量安全检测中心,贵州凯里 556000)

磺胺类药物(Sulfonamides,SAs)和氟喹诺酮类(Fluoroquinolones,FQs)均为化学合成类抗菌药,具有抗菌谱广、使用方便、性质稳定且价格低廉等优点,在兽医临床上和畜牧业生产中被广泛应用;如磺胺类可用于大肠杆菌病等的治疗;与某些抗菌增效剂联用后能够使其抗菌活性得到明显增强,甚至能够呈现杀菌作用[1]。氟喹诺酮类也具有良好的抑菌及杀菌作用,目前我国生产并用于禽类疾病防治的这类药物主要有达氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星和沙拉沙星等。两类药物在体内的作用时间和代谢时间较长,长期使用或者过度使用可能导致在人体中蓄积,进而对人体机能产生危害,也会造成一定的生态环境污染[2-6]。近年来,动物源食品中磺胺类和喹诺酮类药物残留量超标现象十分严重,其残留问题已经引起国际上的高度重视,世界各国对其残留限量均有严格的规定。美国及欧盟等国家对动物性食品中磺胺类药物总量以及单个磺胺药量规定的最大残留限量为100 μg·kg-1[7],欧盟[8-9]规定在动物肌肉中恩诺沙星(恩诺沙星和环丙沙星总和)为100 μg/kg,双氟沙星为300 μg/kg,日本肯定列表[10]规定双氟沙星不得检出、其它几种限量在10～300 μg/kg;我国农业部235号公告也规定磺胺类药物在食品动物中的肌肉和肝脏中最大残留限量为100 μg·kg-1[11],农业部235公告也规定在动物肌肉中各类沙星限量为10～300 μg/kg、2292号公告也规定禁止生产和使用洛美、培氟、氧氟和诺氟沙星。因此加强对动物源性食品中磺胺类和喹诺酮类药物残留的检测监控及残留风险评估是非常必要的。

目前,对动物源性食品中磺胺类和喹诺酮类药物残留的研究主要集中在检测方法方面[12-13],大多都局限于对单一类药物多残留的检测方法研究,且诸多检测标准和方法检测过程冗繁、耗时;而对于对畜禽产品质量安全保障方面的研究则主要集中在追溯体系的建设及管理技术[14-15],对于畜禽产品兽药残留检测与风险评估的研究也仅停留在4～5种磺胺类或几种喹诺酮类药物残留风险分析,两类指标残留检测及风险评估的综合分析尚未见报道。此外三穗鸭产业作为该县主要产业,其产品质量安全直接关系着整个产业发展,因此,亟待建立一种快速同时检测磺胺类药物和喹诺酮药物的方法,并结合兽药残留检测结果对产品进行风险评估。本研究以贵州省特色家禽三穗鸭为研究对象,在三穗鸭集中养殖区域三穗县抽取138份鸭肉样本,通过检测样本中的磺胺类和喹诺酮类药物的残留量,采用食品安全指数法,分析贵州省三穗鸭肉中磺胺类和喹诺酮类药物的残留水平和风险水平,为引导消费、科学监管及三穗鸭产业发展提供数据参考和科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

三穗鸭 2018年6～9月对贵州省三穗县三穗鸭养殖企业(大户、合作社、家庭牧场)作为采样点,现场宰杀现场采集胸脯肉取得样品,严格按照《动物及动物产品兽药残留监控抽样规范》(NY/T1897)执行,每份样品取样量不少于300 g,采集样品138份;药品试剂 磺胺类标准品(磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺多辛、磺胺醋酰、磺胺甲恶唑、磺胺苯吡唑、磺胺异恶唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺喹恶啉),喹诺酮类标准品(二氟沙星、恩诺沙星、达氟沙星、沙拉沙星、环丙沙星、氟甲喹),含量100 μg/mL,农业部环境保护科研监测所;甲醇、乙腈 为色谱纯;水 为超纯水;其余试剂 为分析纯。

UPLC H-Class/TQ-S Micro 超高效液相色谱/三重四级杆质谱联用仪 美国Waters公司;氮气发生器 英国Peak公司;RE2000B旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;T18分散机 德国IKA公司;TDZ5-WS离心机 湖南迈克尔实验仪器有限公司;SCQ-151104E超声波清洗器 上海声彦超声波仪器有限公司;ASE-16固相萃取仪 天津奥特赛恩斯仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制 标准储备液:精密量取磺胺类和喹诺酮类标准品(100 μg/mL)1 mL置10 mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,得相应单个标准储备液(10 μg/mL),于4 ℃保存,保质期3个月。

混合标准品工作液:精密量取上述标准储备液(10 μg/mL)各1 mL置10 mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,作为混合标准工作液(1 μg/mL)于4 ℃保存,现用现配。

1.2.2 样品提取与净化 样品制备:取样品肌肉组织300 g,制成小于或等于2.0 cm×2.0 cm×2.0 cm方块,搅碎,高速匀浆机匀浆后装入样品瓶中,-20 ℃保存备用。

样品提取:称取2.5 g(精确至0.01 g)鸭肉样品,加入10 mL含0.2%甲酸的乙腈/水(80∶20)溶液进行提取。将样品涡旋混1 min、置于摇床上振摇30 min,然后在10000 r/min下离心10 min。

样品净化:将Oasis PRiME HLB vac小柱(6 cc,500 mg)安装在预先清洁过的真空萃取装置上,不需要进行小柱活化。取5 mL提取液过柱,先流出的约1 mL弃去,取剩下的流出液4 mL在45 ℃条件下用微弱氮气流吹干,用10%的乙腈水复溶,经0.22 μm滤膜过滤后,上机测定。

1.2.3 液相色谱-质谱条件

1.2.3.1 色谱条件 采用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm),柱温40 ℃,样品温度20 ℃;流动相为乙腈-水,梯度洗脱模式;流速0.4 mL/min;进样量2 μL,时长15 min。具体参见表1。

表2 质谱参数Table 2 Mass parameters

表1 洗脱梯度Table 1 Elution gradient of sulfonamides

1.2.3.2 质谱条件 采用电喷雾离子源;正离子扫描,多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM),分时间段采集,脱溶剂温度500 ℃,脱溶剂气氮气流速1000 L/h,离子源温度150 ℃,锥孔气流量150 L/h,毛细管电压3.0 kV,碰撞气为氩气。其它质谱参数见表2。

1.2.4 风险分析方法 食品安全指数IFS是用来描述人们对摄入食物中的化学污染物是否对机体存在危害,并通过计算结果来分析食用该食品后对人体安全状态的影响,反映食品受污染程度及消费者受污染物质的危害程度,通过残留监测和膳食暴露评估,能够有效评价食品中的某种化学污染物对人体健康的危害程度,从而指导风险管理并采取相应的措施以降低风险[16-20]。本研究主要采食品安全指数(index of food safety,IFS)法[21-23]进行风险分析。

式中:EDIc为化学物质C的实际日摄入量估算值,等于∑(Ri·Fi·Ei·Pi)[i为不同的食品种类;Ri为食品i中化学物质C的残留水平,mg/kg;Fi为食品i的估计日消费量,g/(人·天);Ei为食品i的可食用部分因子,取1;Pi为食品i的加工处理因子,取1];SIc为安全摄入量,可采用每日允许摄入量(acceptable daily intake,ADI)等数据;本研究以我国农业部制定的兽药每日允许摄入量〔acceptable daily intake,ADI,μg/(kg·bw·d)〕为标准进行评价[11]。bw为平均体重,kg(按60 kg计);f为校正因子,如果安全摄入量应用ADI、RFD、PTDI等日摄入量数值,f可采用1;如果安全摄入量应用PTWI等周摄入量数值,f可采用7[21];

IFSc可以指出食品中的污染物C对消费者健康是否存在危害以及危害的程度:IFSc≪1,表示所检测的药物对人们的健康不会造成危害效应,安全状态可以接受;IFSc≤1,表示所检测的药物对人们的健康造成的危害效应并不明显,所检测的药物对人们健康的风险是可以接受的;IFSc>1,表示所检测的药物对人们健康的风险超出了可接受的限度,所检测的药物对人们的健康造成的危害效应是明显的,出现这种情况就应该进入风险管理程序[21]。

1.3 数据处理

所有测试重复平行实验6次,数据在Waters公司的MassLynx V4.1软件下采集,采用MassLynx V4.1SCN945处理方法对检测结果进行定性定量处理分析,采用1.2.4方法对定量分析结果进行计算IFSc值。

2 结果与分析

2.1 基质标准曲线绘制

实验采用基质匹配标准曲线消除基质效应,采用经检测不含目标物的鸭肉样品作为空白基质样品,称取2.5 g(精确至0.01 g)空白基质样品共7份,置于50 mL离心管中,按1.2.2项样品提取进行操作制备得到空白基质(氮吹后所得的空白基质),用10%的乙腈水配制5、10、50、100、150、200 μg/L的系列标准溶液溶解空白基质得到系列基质标准溶液。以基质标准溶液质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线(见表3)。21种药物的浓度在5～200 μg/L范围内呈现良好的线性关系,R2均大于0.995。

表3 21种化合物的加标回收率、相对标准偏差和检出限(n=6)Table 3 Recovery rates,relative standard deviations(RSDs)and limits of detection(LOD)of 16 kinds of compounds(n=6)

2.2 准确度和精密度试验

采用基质匹配标准溶液-外标法定量,取2.5 g(精确至0.01 g)空白基质样品,分别添加3个不同浓度的磺胺类和喹诺酮类化合物,加标水平5、10、50 μg/kg,按照1.2.2项下的方法进行操作,每个加标水平重复6次,并计算6次平行结果的相对标准偏差(RSD),结果见表3。

从表3可以看出,鸭肉空白基质样品在1、10、50 μg/kg 3个不同浓度进行添加回收加标试验,21种化合物回收率为70.3%～113.2%,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为2.1%～11.5%(n=6);说明该方法对鸭肉中磺胺类和喹诺酮类多残留的测定均有良好的准确度和精密度,符合残留分析的要求。

2.3 检出限和定量限

以信噪比S/N=3确定21种药物的检出限,以信噪比S/N≥10确定其定量限。选择符合一定的准确度和精密度要求的最低浓度,采用加标回收进行验证。15种药物的检出限为0.5 μg/kg,6种喹诺酮类药物的检出限为1.0～2.5 μg/kg,15种磺胺类药物的定量限2.0 μg/kg,6种喹诺酮药物的定量限为5.0 μg/kg。具体结果见表3。

2.4 鸭肉中药物残留检测结果

对所采集的138个三穗鸭肉样品,检测指标21项,检出指标1个为磺胺氯哒嗪,占总指标的4.76%,检出样品3个,检出率2.17%,检出值为2.37～3.68 μg/kg;其余均未检出。所检出指标磺胺氯哒嗪的残留浓度为平均值为3.33 μg/kg,远远低于国家规定的最高残留限量100 μg/kg。所检测的138个样品所检指标均合格。

2.5 鸭肉中磺胺类兽药残留风险分析

该县为三穗鸭主产区,三穗鸭也作为当地主要禽肉消费来源,根据实际调研,其鸭肉摄入量与2016版《中国居民膳食指南》统计的禽肉消费量基本一致,因此采用2016版《中国居民膳食指南》资料显示中国人均禽肉消费量14.7 g/人·日计算,以标准体重60 kg来计各项指标的IFSc值。

根据检测情况,按照检测结果平均值、最大值和最小值计算人体对各种污染物的实际摄入量并与其安全摄入量相比较,并计算各种兽药残留的IFSc值,因我国及JECFA等均无磺胺氯哒嗪的ADI值规定,因此按照国际上其它的一些ADI值规定,磺胺间甲氧嘧啶规定的ADI值最低,为6 μg/(kg·d),因此以磺胺间甲氧嘧啶为基准计算食品安全指数,具体见表4。

根据表4可知,三穗鸭中磺胺氯哒嗪的平均每日暴露量为0.0008 μg/kg bw/d,最大值为0.0009 μg/kg bw/d,最小值为0.0006 μg/kg bw/d,虽然我国及JECFA等均无磺胺氯哒嗪的ADI值规定,但是仍然可与我国规定的一些磺胺类ADI值作比较(我国规定的磺胺类ADI值分别为 10、20、50 μg/(kg·d);部分国家如澳大利亚规定磺胺间甲氧嘧啶ADI值为6 μg/(kg·d)[24],可以看出其每日暴露量值远小于与我国所规定的磺胺类ADI最小值10 μg/(kg·d),与部分国家规定的6 μg/(kg·d)相比较,也远小于该值,表明其中的磺胺氯哒嗪残留对人体的潜在危害水平是可以接受的。

此外,以国际上规定的磺胺间甲氧嘧啶ADI值为基准计算IFSc值,其IFSc值平均值为0.00014,最小值为0.00010,最大值为0.00016,均远远低于1;这表明三穗鸭中磺胺类药物的残留对人健康无直接危险,其潜在危害水平是可以接受的。

表4 检出指标膳食暴露及食品安全指数Table 4 The EDI and IFS of detection index in duck

注:我国及JECFA等均无磺胺氯哒嗪的ADI值规定,其ADI值参照磺胺间甲氧嘧啶的规定6 μg/(kg·d)。

4 结论

本研究采用0.1%甲酸乙腈提取样品中的磺胺类和喹诺酮类药物,经Oasis PRiME HLB vac小柱净化,用超高效液相色谱法-串联质谱法测定鸭肉中的15种磺胺类药物和6种喹诺酮类药物残留,采用外标法进行定量。在添加浓度5～50 μg/kg的范围内,回收率为70.3%～113.2%,相对标准偏差为2.1%～11.5%(n=6);均符合兽药残留测定允许范围,方法提取效率高、净化效果好,能提高工作效率。该方法能对鸭肉中的兽药残留进行快速定性和定量分析,具有较高的回收率、良好的精密度、较高准确度,选择性好,操作快速、简便,适用于禽肉中上述15种磺胺类药物和6种喹诺酮类药物残留的快速检测分析。

本研究中三穗鸭肉中氟喹诺酮类均未检出,磺胺类仅检出磺胺氯哒嗪,其值也远远低于国家对磺胺类药物的限量规定,这说明三穗鸭肉磺胺类和喹诺酮类药物残留水平较低;此外其IFS远小于1,表明三穗鸭肉产品中磺胺类和喹诺酮类药物兽药残留对人体的健康不会造成危害,风险是可以接受的。这21种药物在三穗鸭肉中残留不会对消费者身体健康产生危害,不必进入风险管理程序。

虽然三穗鸭中检出的磺胺类药物均未超过国家最大残留限量规定,也不会对人体健康造成直接危害,但是其仍然影响三穗鸭肉产品质量,仍是影响其质量安全的风险隐患因子,各相关部门须引起重视;因此需加强监管力度和抽检力度,确保产品质量安全和产业健康发展。