某猪场猪瘟和圆环病毒2型混合感染的诊断与防治

李丽娜

某猪场猪瘟和圆环病毒2型混合感染的诊断与防治

李丽娜

（山东省莱阳市动物疫病与控制中心 265200）

猪瘟病毒和圆环病毒2型是当前严重危害养猪业的重要传染病，猪瘟以高发病率和高死亡率著称，圆环病毒2型感染后会引起PMWS、PDNS等疾病，还会侵害猪的免疫系统，降低猪体对各种疾病的抵抗力。

猪瘟俗称"烂肠瘟"，是由黄病毒科猪瘟病毒属的猪瘟病毒引起的一种急性、发热、接触性传染传染病。可表现为急性、亚急性、慢性、不典型或不显症状的病程。具有高度传染性和致死性。本病在自然条件下只感染猪，不同年龄、性别、品种的猪和野猪都易感，一年四季均可发生。猪圆环病毒2型(PCV2)属于圆环病毒科圆环病毒属，病毒粒子大小为14~25nm，无囊膜，基因组为单股环状DNA，严重侵害猪的免疫系统，病毒与巨噬细胞/单核细胞、组织细胞和胸腺巨噬细胞相伴随，导致患猪体况下降，形成免疫抑制。临床症状最常见的是猪只渐进性消瘦或生长迟缓，其他症状有厌食、精神沉郁、行动迟缓、皮肤苍白、被毛蓬乱、呼吸困难，咳嗽为特征的呼吸障碍。

2018年11月份，山东禹城某养猪场自繁自养，母猪存栏量100头的养殖场发生疫情，保育舍300头存栏，部分保育舍猪出现体温升高至41~42℃，食欲减少，沉郁，眼、鼻黏膜充血，极度衰弱。发病猪不食、精神差、喜卧、弓背、寒战等症状外，其他典型症状有眼结膜发炎，有脓性分泌物，有时可见眼结膜小点出血。鼻黏膜发炎，有脓性分泌物。病初便秘，粪便发黑，如算盘珠子。病后期腹泻、恶臭、粪带黏液或血。在病猪鼻端、耳后、腹部、四肢内侧等皮薄毛稀处可见大小不等的紫红色斑点，指压不褪色；有的猪只渐进性消瘦，皮肤苍白、被毛蓬乱、呼吸困难。一般发病后5~7d死亡，发病率达到60%，死亡率50%以上。使用多种抗生素药物治疗均无效。怀疑该猪场同时感染了猪瘟病毒和圆环病毒。为了对该猪场病情进行确诊，本研究对疑似病例进行了病理解剖、RT-PCR/PCR基因组核酸检测，对感染猪病原做出了准确判断，为及时采取针对性的紧急防疫和对症用药提供了依据。

1 材料与方法

1.1 病理剖检和样品采集

对2例病死猪进行解剖，观察猪内脏器官如淋巴结、肺、脾、肾、喉头和气管的病理变化。分别采集病猪的扁桃体、淋巴结、肾、脾、肺组织各少许，-20℃低温保存备用。同时采集2头发病活猪的血液2ml，2000rpm离心取血清冷冻保存。

1.2 材料和试剂

CSFV和PCV2阳性对照由本实验室保存；RT-PCR/PCR一步法试剂盒、凝胶回收试剂盒等购自大连宝生物工程有限公司；PTC-2000型PCR仪购自美国MJ Research公司。

1.3 引物设计与合成

1.3.1 CSFV引物设计与合成 CSFV引物由本实验室设计，在上海生工生物工程技术服务有限公司合成。扩增片段大小为250bp。引物序列为F：5’-AAACGGAGGGACTAGCCGT-3’，R：5’-GAT TCAACTCCATGTGCCATG-3’。

1.3.2 PCV2引物设计与合成 PCV2引物引物由本实验室设计，在上海生工生物工程技术服务有限公司合成。扩增片段大小为721bp。引物序列为F：5’-CAACAGCATGCCCAGCAAGAAGAAT-3’，R：5’-TAGATTACACAGTCTCAGTAG-3’。

1.4 样品的处理与DNA/RNA提取

取2g左右的病料于研磨器中剪碎并研磨，加入适量的PBS研磨混匀后放入1.5ml离心管中-20℃反复冻融3次，5000rpm4℃离心2min；取250ml上清放入另一个1.5ml离心管中，加入750ml Trizol和200ml氯仿，震荡混匀，-20℃静置5min，12000rpm 4℃离心15min；取500ml上清加入等量的异丙醇，颠倒数次，-20℃静置20min，12000rpm 4℃离心15min，倒掉上清，收集沉淀；75%酒精1ml洗涤沉淀，吸净水，干燥，加入20ml灭菌水溶解沉淀即为样品DNA/RNA，-80℃保存备用。

1.5 PCR/RT-PCR扩增

（1）利用一步法RT-PCR对CSFV核酸进行检测，具体操作如下：反应体系为25ml，其中：2× One Step PrimeScript™ III RT-qPCR Mix12.5ml，上、下游引物F、R(10mmol/L)各1ml，RNA模板3ml，RNase-free ddH2O 7.5ml。反应程序为：50℃ 30min(反转录)，95℃ 2min(预变性)；94℃ 1min(变性)，52℃ 1min(退火)，72℃ 1min(延伸)，重复30个循环。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行条带检测。（2）利用PCR对PCV2核酸进行检测，具体操作如下：反应体系为25ml，其中：2×PCR Master mix 12.5ml，上、下游引物F、R(10mmol/L)各1ml，DNA模板3ml，RNase-free ddH2O 7.5ml。反应程序为：94℃ 3min(预变性)；94℃ 40s(变性)，55℃ 40s(退火)，72℃ 40s(延伸)，重复35个循环。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行条带检测。

2 结果与分析

2.1 病理剖检

解剖该猪场送检的2例病死猪，发现以下病理变化：喉头出血严重；下颌和腹股沟淋巴结肿大出血，切面呈大理石花纹样；肺有一病例汽肿或萎缩出血，尖页处有肉变现象，颜色发白；脾脏边缘出现多处黑色梗死；肾脏出血严重，成麻雀蛋样，贫血发黄；肠系膜淋巴结肿大；膀胱粘膜散布点状出血。根据剖检的病理变化可以初步判断为这两例病死猪为猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染，并结合实验室诊断进行确诊。

2.2 RT-PCR检测结果

采集的两例病料提取RNA后，进行RT-PCR扩增，电泳结果显示，两例病料样品都有一条272bp的特异DNA片段，与目的片段大小一致(图1)，且为强阳性。说明所检的两个样品为CSFV阳性(表1)。

表1 采用RT-PCR方法对猪瘟病毒的抗原检测结果

2.3 PCR检测结果

采集的两例病料提DNA后，进行PCR扩增，电泳结果显示，病料1样品有一条648bp的特异DNA片段，与目的片段大小一致(图2)，且为强阳性。说明所检的病料1样品为PCV2阳性(表2)。

表2 采用PCR方法对猪II型圆环病毒的抗原检测结果

图1 RT-PCR扩增产物凝胶电泳结果

图2 PCR扩增产物凝胶电泳结果

2.4 结果判定

通过病理解剖、PCR和RT-PCR对样品进行检测后，确诊该猪场病死猪为猪瘟病毒和猪圆环病毒2型混合感染。

3 讨论

（1）对猪瘟的诊断，在临床上可以通过该病的临床症状和病理解剖做出初步的诊断。如果该猪群再混合感染其他一些疾病，就很难通过肉眼的观察来诊断该猪群的疾病发生情况。而且近几年来猪瘟的流行情况和发病特点发生了很大的变化，呈多样性、非典型性，这就使猪瘟在临床病变上没有明显的和非常典型的病变。在加上其他疾病的侵扰，给猪病的临床诊断带来了不小的麻烦。所以如需准确的诊断还需要通过实验室手段。目前实验室多采用一步法PCR/RT-PCR法快速进行检测，提高了检测效率，还能最大限度的减少了操作过程中污染和假阳性情况的出现。（2）本研究采用临床剖检和实验室检测，对该猪群猪瘟病毒和圆环病毒2型的疑似病例进行了准确的诊断，并指导该猪场采取相应的有效措施对全群猪进行防治。全群保育猪紧急免疫猪瘟细胞苗，2头份/头，一周后再注射圆环病毒II型疫苗1头份/头。同时为了防止猪群保育猪继发感染其他细菌病，在其饲料中添加30%的阿莫西林(250g/t饲料)和黄芪多糖提取物(500g/t饲料)。对发病比较严重的个体按照体重注射头孢噻呋钠和黄芪多糖注射液，连续注射3~5d。全群保育猪饮水中加入维生素C和电解多维，连续饮水1周，较少由于疾病和注射疫苗对猪体造成的应激。（3）对病死猪及时进行深埋或无害化处理，严格控制发病猪的流动，防治疫情进一步扩散。保持饲养工具的洁净，加强通风，改善猪舍饲养环境。进行严格消毒制度，对全场用具、饲养环境和周围环境消毒，每两周一次环境大消毒，每周两次带猪消毒。

由于诊断及时准确，并为其提供了一套系统的防治措施，在严格提供的防治措施执行后疫情的到了有效的控制，3d后猪群不再有死亡个体，采食量有所增加。10d后猪群的采食量和疫情都控制住。

（2019–08–18）

S858.28

B

1007-1733(2019)11-0036-03